Synthesis and applications of quantum dots for TNT sensing and bioimaging

Master2,4,6-trinitrotoluene (TNT) have threatened human safety and health with its features such as explosion and toxicity. The need for detection of TNT has been magnified to protect human safety and health from TNT. To satisfy this, the TNT turn-on sensor in the form of film was fabricated by layer by layer assembly. The film was composed of phage and quantum dot as function of high-specific binding with TNT and fluorescence signal depending on concentration of TNT, respectively. Layer-by-layer assembly was successfully performed hybridization of phage and quantum dot and guarantee of optical property of quantum dot as dispersing quantum dot into matrix. The Black hole quencher 2 – COOH was selected as a quencher due to broad absorption spectrum which overlaps with emission spectrum of quantum dot and the structure having analogue of TNT in order that quencher might form weak interaction with phage in the film. The fluorescence of quantum dot in film was successfully quenched by Black hole quencher 2 – COOH. Using Stern-Volmer equation, the quenching constant was calculated to 1.36 μM-1.The sensitivity and selectivity for TNT were investigated. When the quenched film had been incubated in different concentration of TNT aqueous solutions, the more than half of fluorescence intensity in the film was recovered even in case of 1nM of TNT aqueous solution because of high binding affinity between phage and TNT. It was confirmed the detection limit of TNT showed below 1nM of TNT solution. In case of 2, 4 – dinitrotoluene (DNT), the fluorescence intensity in the film remained less than half of fluorescence intensity independent of DNT concentration. The TNT sensor fabricated by simple and versatile layer by layer assembly is expected to detect TNT efficiently.Quantum dots have been attracted attention as fluorescent imaging probe because of their good optical properties such as high quantum yield, resistance against photobleaching, broad absorption and narrow emission spectra and tunable emission wavelength from visible to near infrared light region. Many efforts have been dedicated to use quantum dots based on CdTe as imaging probe in near-infrared region (700~900nm). But, quantum dots based on CdTe have been suffered from low quantum yield caused by sensitivity to oxidation. CdTeSe/CdSe/CdS/ZnS (core/shell/shell/shell) quantum dots were synthesized by changing several conditions. The quantum dots showed high quantum yield (up to 80%), narrow full width at half maximum and tunable emission wavelength in 700~800nm. Optimal synthesized quantum dots were prepared complex with hyaluronic acid for imaging and targeting probe. Hyaluronic acid – quantum dot complex was demonstrated great capability of imaging and targeting probe to specific cancer cells in vitro. This research might be assessed as a small landmark for in vivo imaging.본 논문에서는 TNT 양에 따른 양자점의 형광 세기 변화를 통해 TNT를 탐지할 수 있는 필름 형태의 TNT Turn – on 센서 개발 및 표면에 세포 수용체를 도입시킨 양자점의 형광으로 특정 세포를 시각화하고 표적할 수 있는 탐침 (Probe) 응용에 대한 연구를 서술하였다. 양자점은 유기 염료에 비해 양자 효율이 높고, 광표백에 대한 저항이 강하다. 또한 흡광 영역이 넓지만 형광 파장이 좁으며 양자점의 크기를 조절하여 흡광 및 형광 파장을 조절할 수 있다. 따라서 유기 염료를 대체할 발광 소재로 각광받고 있으며, 향후 양자점을 응용한 센서, 형광 영상 탐침 및 광학 소자 등이 개발될 것으로 전망되고 있다.필름 형태의 TNT Turn-on 센서의 성분은 TNT를 고특이적으로 인식할 수 있다고 알려진 파지 (WHW 파지)와 양자점으로 구성되었다. 소광체로 필름에 있는 양자점의 형광을 소광시킨 다음, TNT가 필름 주변에 있는 경우 WHW 파지와 TNT의 강한 결합 친화력 (Binding affinity)으로 인해 소광체와 TNT의 위치가 바뀜으로서 소광되었던 양자점의 형광이 회복되어 TNT를 탐지할 수 있도록 디자인하였다. 센서는 층상 자기 조립법 (Layer-by-layer assembly)을 사용하여 다층 필름 형태로 제작되었다. 필름을 만들기 전, 양자점의 표면에 양전하를 띠는 리간드를 도입함으로서 양전하를 띠는 양자점을 미리 준비하였다. 정전기적 인력에 의해 양전하를 띠는 양자점과 음전하를 띠는 WHW 파지를 결합 시킬 수 있었다. WHW 파지 및 양자점을 한 층씩 증착시킬 때마다 양자점의 흡광값 증가를 통해 WHW 파지 및 양자점이 성공적으로 증착되었음을 알 수 있었다. 또한 WHW 파지와 양자점을 증착한 횟수, WHW 파지의 크기 및 양자점의 수화 크기와 횡단면 주사전자현미경 (Cross sectional SEM)으로 측정한 필름의 전체 두께를 고려하였을 때 필름이 다공성 구조를 형성하였음을 추측할 수 있었다. 필름에 있는 양자점이 소광체에 의해 양자점의 형광이 성공적으로 소광되었음을 확인하였다. 농도가 1nM인 TNT 용액에 양자점의 형광을 소광시킨 필름을 담갔을 때, 양자점의 형광세기는 형광이 소광되기 전 양자점의 형광세기의 반 이상 회복된 것을 관찰하였다. 필름의 선택적인 TNT 탐지 능력을 알아보기 위해 TNT의 유사구조인 DNT로 위에서 언급한 실험을 반복하였다. 하지만 DNT의 농도와 관계없이 양자점의 형광세기가 소량 회복된 것을 관찰하였다. WHW 파지의 대조군으로는 유전자 조작을 거치지 않은 M13 파지 (Wild 파지)를 선정하였다. Wild 파지로 필름을 제작하여 소광체로 양자점의 형광을 소광시킨 후 TNT 용액에 담가 양자점의 형광 회복을 관찰하였지만, TNT의 농도와 관계없이 양자점의 형광이 거의 회복되지 않았다. 위의 실험 결과들을 통해 WHW 파지 및 양자점으로 제작된 TNT Turn-on 센서는 1nM이하의 TNT를 선택적으로 탐지할 수 있음을 확인하였다.양자점을 형광 영상 탐침으로 사용하기 위해서는 양자 효율이 높고 형광 반폭 (Full width at half maximum)이 좁은 양자점이 선호되는데, 이는 강한 형광 신호로 다중화된 영상(Multiplexing)을 구현하는데 적합하기 때문이다.또한 근적외선 영역(700~900nm)은 가시광선 영역에 비해 조직의 빛 흡수, 산란 및 자가 형광이 적기 때문에 근적외선 영역의 빛을 사용하면 생체 내 형광 영상을 관찰할 수 있는 깊이가 증가할 수 있다. 이에 근적외선 영역을 내는 양자점을 합성하여 형광 영상 탐침으로 사용한 사례가 보고되었지만 형광이 약하다는 단점이 있었다. 이러한 단점을 극복하고 근적외선 영역에서 양자점을 효과적인 형광 영상 탐침으로 사용하기 위해 본 연구에서는 CdTeSe/CdSe/CdS/ZnS (핵/껍질/껍질/껍질) 양자점을 합성하였다. 핵의 격자 상수 및 껍질의 격자 상수의 차이를 좁혀 핵 위에 무기 껍질이 잘 올라갈 수 있고, 핵의 띠간격보다 띠간격이 큰 물질을 선택하여 핵 안에 전자 – 정공쌍이 핵의 띠간격에 가두어져 강한 형광을 낼 수 있도록 CdSe, CdS 및 ZnS 무기 껍질을 선택하였다. 기존 합성 방법에서 핵/껍질 양자점을 합성할 때는 핵에 껍질을 올리기 전 핵에 남아있는 전구체를 제거하고 껍질 전구체를 넣어주었다. 하지만 본 논문에서는 핵의 표면 결함 및 핵과 껍질 사이에 급격한 격자 불일치를 줄이기 위해 양자점의 핵을 합성한 상태에서 연속적으로 껍질 전구체를 넣어 핵/껍질 양자점을 합성하였다. 합성한 양자점은 흡광, 형광 스펙트럼 및 TEM을 측정하여 양자 효율, 형광 반폭 및 양자점의 크기를 확인하였다. 양자효율은 약 80% 이상으로 측정되었으며 형광 반폭은 40~50nm로 확인되었다. 양자점의 핵에 서로 다른 성분의 껍질이 올라갔을 때 양자점의 크기가 소량씩 증가하는 것으로 양자점의 핵에 껍질이 얇게 올라갔음을 알 수 있었다.양전하를 띠는 양자점과 음전하를 띠는 히알루론산을 정전기적 인력으로 결합시킨 히알루론산 – 양자점 복합체를 제조하고 세포 영상 탐침으로 사용하였다. 실험에 쓰인 세포는 히알루론산 수용체가 발현되었다고 알려진 자궁경부암 세포 (HeLa 세포) 및 자궁경부암 세포의 대조군으로 사람 진피 섬유아세포 (Human dermal fibroblast)였으며, 각 세포에 히알루론산 – 양자점 복합체를 넣어 형광을 관찰하였을 때 자궁경부암 세포에서 강한 형광 신호를 확인하였다. 이를 통해 히알루론산 – 양자점 복합체가 특정 세포를 시각화하고 표적할 수 있는 탐침으로 작용하였고, 향후 생체 내 영상 탐침으로도 쓰일 수 있다는 가능성을 보여주었다