Identification of Cis-Regulatory Elements Specific for Sonic Hedgehog Expression in Bladder Cancer

MasterDNA 메틸화는 잘 알려진 후성유전학적 현상의 일종으로서, 염색질의 구조 변형과 유전자의 전사 조절에 관련 있다. DNA 메틸화가 주로 일어나는 CpG 다이뉴클레오타이드 (CpG dinucleotide)가 밀집해 있는 지역을 CpG 섬 (CpG island) 라고 하는데, 대부분 프로모터(Promoter)의 근처에 위치한다. DNA 메틸화가 프로모터에서 일어나게 되면 염색질 구조의 변형을 유도하거나, 전사 인자들과 결합을 저해하여, 유전자의 발현을 억제한다. 비정상적인 메틸화는 암과 같은 질병의 원인으로도 알려져 있다. 특히, 암에서는 종양억제유전의 프로모터에 있는 CpG 섬에 과메틸화(hypermethylation)가 일어나 침묵현상(gene silencing)이 일어난다고 알려져 있다. 또한 연구에 따르면 CpG 섬뿐만 아니라, CpG 섬 근처 2 kb 범위를 지칭하는 CpG 해안 (CpG island shore)에서도 비정상적 메틸화가 일어난다고 알려져 있다. 종양억제유전자의 특정부위 메틸화현상은 암을 진단하는 생체제표(biomarker)로 쓰일 수 있기 때문에, 암에서 특이적으로 나타나는 메틸화 부분을 찾는 연구들이 진행되고 있다. 최근, 발달과 재생에 중요한 Hedgehog 경로의 리간드인 Sonic hedgehog (Shh) 발현이 방광암 진행 중에 사라지며, 이로 인해 방광암이 침윤성을 띄는 악성종양으로 발전한다는 연구결과가 알려졌다. 연구에 따르면 Shh 이 다시 발현이 될 경우 암의 진행을 저해한다는 결과를 통해 Shh가 종양억제유전자로서 작용할 수 있음을 제시하였다. 하지만, 방광암에서 어떻게 Shh 의 발현이 사라지는지는 정확히 알려진 바가 없다. 최근 진행된 방광암 유전체 분석을 통해 유전자 서열의 돌연변이보다는 전사를 조절하는 후성유전학적 돌연변이에 의한 것을 유추할 수 있었다. 본 연구는 방광암에서 Shh 이 후성유전학적인 원인에 의하여 조절된다는 것을 증명하고 그 기작을 알아내고자, Shh 의 DNA 메틸화 경향을 파악하고 원인을 분석하는 연구를 진행하였다. 메틸화의 경향을 파악할 수 있는 Bisulfite 염기서열분석을 활용하여 방광의 정상조직과 암조직의 메틸화 상태를 분석한 결과, 방광암에서 과메틸화가 나타난 것을 확인하였다. 세부적으로는 Shh 의 과메틸화가 일어난 부위가 CpG 섬이 아니라, CpG 섬에서 2kb 거리의 상류에 존재하는 CpG 해안 부위인것을 것이 확인되었다. DNA 메틸화 억제제를 처리하였을 때, CpG 상류해안 (CpG up-shore)에서 유의미한 메틸화 감소가 나타났고, shh 의 발현이 급격하게 증가한 것을 확인하였다. 이를 통해 방광암에서 shh 이 사라지는 것은 비정상적 메틸화현상에 의한 것이며, CpG 상류해안과 연관 있음을 밝혔다. 더 나아가, CpG 상류해안에서 메틸화에 영향을 받아 직접적으로 전사를 조절하는 기작을 확인하기 위하여 CpG 상류 해안을 표적하여 탈메틸화를 진행하였다. 개조된 CRISPR/Cas9에 Tet1 탈메틸화 반응기를 접합한 dCas9-Tet1 시스템을 이용하여, Shh 의 CpG 상류해안을 부분적으로 탈메틸화 시킨 결과 Shh 이 재활성화 되는 것을 확인하였다. 또한 이러한 재활성화가 CpG 상류해안 전체의 탈메틸화가 아니라 부분적 탈메틸화로 야기되는 것을 통해, CpG 상류해안에 전사를 조절하는 특정한 부위가 있음을 알 수 있었다. 확인된 특정부위를 생물정보학적으로 분석한 결과, 유전자 특이적인 전사인자와 결합하는 모티프 (Transcription factor binding motif)들이 존재하는 것을 확인하였다. 이를 통해, CpG 상류해안은 Shh 특이적인 전사인자들과 상호작용을 하여 Shh 을 조절하는 Cis -regulatory element 들이 존재함을 예상할 수 있게 되었다. 결론적으로 본 연구는 방광암 진행과정 중 비정상적 DNA 메틸화로 인하여 Shh 침묵현상이 일어난 것을 밝혔다. 또한 Shh CpG 상류해안에 위치한 Cis-regulatory element 가 메틸화의 영향을 받아 전사인자와 같은 여러 요소와의 상호작용이 비정상적으로 조절되었을 것임을 제시하였다. 이러한 연구결과들은 추가적인 연구가 진행됨에 따라 Shh 침묵과 관련한 기작을 밝히는 기반이 되며, Shh 가 방광암에서 biomarker 등의 치료용 연구자료로 활용될 수 있을 것이다.Recent studies revealed that mammalian Sonic Hedgehog (Shh) expression is lost in the muscle-invasive urothelial tumor. Interestingly, since the Shh gene was rarely mutated in the bladder cancer genome studies, it was assumed that the downregulation of the gene was not due to genetic alteration, but epigenetic silencing. Also, the relevant molecular mechanisms are still unknown. Here, I illustrate that hypermethylation causes loss of Shh expression in bladder cancer. Inhibition of DNA methyltransferase has increased the shh expression and reduced the occupancy of methylated CpG dinucleotides in upstream CpG island shore dramatically. Additionally, defining precise regulatory regions related to epigenetic silencing is necessary to understand the molecular mechanisms. In this study, I utilized a site-specific demethylation system for the identification of potential cis regulatory elements for Shh transcription in bladder cancer. Therefore, these findings provide a molecular basis of Shh expression in urothelial carcinoma and suggest that a novel regulatory region for Shh transcription exists in the CpG island shore