Impact of Toxoplasma gondii infection on HLA expression in human monocytes

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulär lebender einzelliger Parasit, der sich durch ein breites Wirtsspektrum sowie lebenslang persistierende Infektionen bei Menschen und Tieren auszeichnet. T. gondii hat für ein langfristiges Überleben unterschiedliche Mechanismen entwickelt, die ein Gleichgewicht zwischen der Pathogenität des Erregers und der intakten Immunabwehr des Wirtes gewährleisten. In diesem Kontext stellt die Modulation von Signalwegen der Wirtszelle eine wichtige Überlebensstrategie von Toxoplasmen dar. Frühere Arbeiten mit murinen Monozyten haben gezeigt, dass T. gondii die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen auf der Oberfläche infizierter Wirtszellen hemmt und dadurch eine effektive Antigenpräsentation an T-Helfer-Lymphozyten verhindert. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es herauszufinden, inwieweit Toxoplasma gondii auch die Interferon-γ-induzierte MHC-Expression von Monozyten des Menschen vermindert. Analysen mittels Immunfluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie zeigten, dass sowohl primäre, aus PBMC des Menschen isolierte Monozyten als auch permanente humane Monozyten (THP-1) durch eine Infektion mit T. gondii in der Expression von HLA-A, -B, -C und HLA-DR, -DP, -DQ signifikant gehemmt werden. Das Ausmaß der Inhibition ist dabei von der Infektionsdosis des Parasiten abhängig und betrifft sowohl die HLA-Expression auf der Zelloberfläche als auch den intrazellulären HLA-Pool. Interessanterweise kann dieser Effekt auch durch hohe Konzentrationen des stimulierenden Zytokins Interferon-γ nicht aufgehoben werden. Es zeigt sich außerdem eine signifikant reduzierte Expression von HLA-DR, -DP, -DQ bei Parasit-negativen Zellen einer T. gondii-infizierten Kultur, was möglicherweise durch sezernierte Proteine des Parasiten oder durch die Produktion hemmender Zytokine durch infizierte Wirtszellen begründet sein kann. Die HLA-Expression in in vitro-infizierten und nicht-infizierten primären Monozyten wurde darüberhinaus zwischen T. gondii-negativen Individuen und Spendern mit chronischer Toxoplasmose verglichen. Chronisch mit T. gondii infizierte Blutspender wurden serologisch anhand von spezifischen IgG-Antikörpern identifiziert. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass Monozyten aus chronisch mit T. gondii infizierten Blut-Spendern signifikant mehr HLA-A, -B, -C und HLA-DR, -DP, -DQ exprimieren als Monozyten aus Toxoplasma-negativen Spendern. Eine Erklärung für diese gesteigerte MHC-Expression könnte eine Dominanz bestimmter Monozyten-Subpopulationen in Abhängigkeit vom Infektionsstatus ihres Spenders sein. Die Expression von HLA-A, -B, -C und HLA-DR, -DP, -DQ wird jedoch sowohl bei Monozyten von T. gondii-positiven als auch nicht-infizierten Individuen durch eine Infektion mit Toxoplasmen in vitro signifikant inhibiert. Analysen mit Hilfe von RT-qPCR zeigten deutlich, dass T. gondii mit der HLA-DR-, -DP-, -DQ-Expressions-Kaskade interferiert und die Synthese der Transkripte von IRF-1 und CIITA dosisabhängig inhibiert. Außerdem sind die Transskripte für HLA-A und HLA-DRα in infizierten Monozyten deutlich reduziert. Dies legt die Annahme nahe, dass T. gondii die Aktivierung von STAT1-abhängigen Promotoren effektiv inhibiert und so die Synthese der sich anschließenden HLA-Expressionskaskade supprimiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit eröffnen interessante Ansätze für weitere Untersuchungen, insbesondere eine genauere Charakterisierung von Monozyten-Subpopulationen bei T. gondii-positiven Individuen sowie die Erforschung einer möglicherweise gesteigerten Immunreaktivität gegen andere Infektionserreger im Rahmen einer chronischen Toxoplasmose.Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite which infects a broad range of mammalian and avian hosts and which leads to lifelong persisting infections in humans and animals. For long-term survival in immunocompetent hosts, T. gondii has developed different mechanisms which facilitate a balance between the pathogenicity of the parasite and the immune defense of the host. In this regard, the modulation of signaling pathways of the host cell represents an essential strategy for survival. Is has been reported previously that after infection, T. gondii inhibits the expression of MHC molecules on the surface of murine monocytes thereby inhibiting antigen presentation to CD4+ T lymphocytes. The aim of this dissertation was to investigate whether Toxoplasma gondii also inhibits the interferon-γ (IFN-γ)-induced expression of MHC molecules in human monocytes. Immunofluorescence staining and flow cytometry revealed that primary PBMC-derived human monocytes and permanent human monocytes (THP-1) both express significantly lower levels of HLA-A, -B, -C and HLA-DR, -DP, -DQ molecules after infection with T. gondii than non-infected controls. The extent of inhibition depends on the infection dose and affects expression of both the intracellular and cell surface HLA molecules. In addition, even high doses of the stimulating cytokine IFN-γ is not able to abolish the parasite-mediated down-regulation of HLA expression. A significant reduction of the expression of HLA-DR, -DP, -DQ was also observed in parasite-negative cells of a T. gondii-infected monocyte population which may be due to a secreted effector protein of T. gondii or inhibitory cytokines of infected host cells. Strikingly, when comparing the infectious status of the blood donors, it was unraveled that monocytes isolated from individuals with chronic toxoplasmosis expressed significantly more HLA-A, -B, -C and HLA-DR, -DP, -DQ molecules than monocytes isolated from T. gondii-negative donors. This might indicate a predominance of a distinct monocyte subpopulation depending on the infectious status of the donor. Nevertheless, expression of HLA-A, -B, -C and HLA-DR, -DP, -DQ in monocytes from both parasite-positive and parasite-negative individuals is significantly inhibited after in vitro infection with T. gondii. Analysis by RT-qPCR showed a dose-dependent interference of Toxoplasma gondii with the mRNA levels of the IFN-γ-regulated transcription-factors IRF-1 and CIITA. Moreover, the transcript levels of HLA-A and HLA-DRα are also strongly reduced in infected monocytes. This suggests that T. gondii successfully inhibits the activation of STAT1-depending promoters thereby abolishing the up-regulation of IFN-γ-regulated HLA expression. Together, the present work demonstrates for the first time that T. gondii dose-dependently inhibits the expression of HLA-A, -B, -C and HLA-DR, -DP, -DQ molecules in primary human-derived monocytes. Furthermore it is shown that monocytes from patients chronically infected with T. gondii exhibit a stronger expression of HLA-A, -B, -C and HLA-DR, -DP, -DQ molecules than monocytes from Toxoplasma-negative donors. These results open up interesting questions for further investigation, particularly a more precise characterization of monocyte subpopulations in T. gondii-positive individuals and clinical trials with regard to a possibly increased immune reactivity of patients with chronic toxoplasmosis.2013-05-2