IFN-γ-mediated infection defence against <i>Toxoplasma gondii</i> in murine skeletal muscle cells <i>in vitro</i>

Toxoplasma gondii ist ein weit verbreiteter intrazellulärer Parasit, der jede kernhaltige Zelle von warmblütigen Tieren und des Menschen infizieren kann. T. gondii persistiert in diesen Organismen besonders in Nerven- und Muskelgewebe lebenslang. In immunkompetenten Wirten verläuft eine Infektion meist asymptomatisch, jedoch kann die chronische Infektion in immunsupprimierten Individuen reaktivieren und unter anderem eine tödliche Enzephalitis auslösen. Ebenso kann T. gondii während einer Erstinfektion diaplazentar von der Mutter auf das ungeborene Kind übertragen werden und zu schweren Missbildungen des Fötus oder zum Abort führen. Einer der Hauptübertragungswege von Toxoplasma auf den Menschen ist die Aufnahme von Gewebszysten in unzureichend gegartem Fleisch chronisch infizierter Schlachttiere. Obwohl der Parasit bevorzugt im Muskelgewebe persistiert, ist bisher nur wenig über die Mechanismen bekannt, die zu seiner Differenzierung und Persistenz gerade dort führen. In dieser Arbeit wurde die Wirkung der proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und TNF, die eine zentrale Rolle bei der Parasitenabwehr und Stadiendifferenzierung spielen, auf die Parasitenentwicklung in Skelettmuskulatur untersucht. Für die Analysen auf zellulärer Ebene wurden sowohl permanente C2C12-Myoblasten als auch primäre murine Skelettmuskelzellen (SMZ) verwendet. Beide SMZ-Linien wurden für die Experimente in vitro zu Myotuben differenziert. Die Differenzierung der SMZ wurde durch den Nachweis muskelspezifischer Marker verifiziert. In dieser Arbeit wurde ein deutlich antiparasitärer Effekt von IFN-γ in SMZ, aber in wesentlich geringerem Maße in Kontroll-Fibroblasten nachgewiesen. TNF hat nur in permanenten SMZ einen synergistischen Effekt zu IFN-γ und senkt die Wachstumsraten zusätzlich zu IFN-γ geringfügig. Bemerkenswerterweise wird die Stadienkonversion von Toxoplasma-Tachyzoiten in da s ruhende Bradyzoiten-Stadium durch die Zugabe von IFN-γ in SMZ und Fibroblasten gehemmt. Die Effektormechanismen der IFN-γ-vermittelten Parasitenabwehr gegen T. gondii umfassen unter anderem die Produktion von zytotoxischem Stickstoffmonoxid (NO) durch die induzierbare Stickstoffmonoxid Synthase (iNOS). Besonders in permanenten, aber auch in primären SMZ wurde im Gegensatz zu Fibroblasten eine deutliche Steigerung der Transkriptmengen des murinen iNOS-Gens NOS2 durch Aktivierung der Zellen mit IFN-γ gemessen. Ebenfalls wurde eine effektive Nitritproduktion nach IFN-γ-Aktivierung in SMZ bestätigt. Die Verwendung eines iNOS-Inhibitors zeigt jedoch, dass iNOS an der Abwehr von T. gondii in SMZ beteiligt ist, aber noch andere Mechanismen existieren müssen. Als weiterer IFN-γ-vermittelter Effektormechanismus ist die Aktivierung der IRG-Proteine (p47-GTPasen) beschrieben. In IFN γ-stimulierten SMZ und Fibroblasten findet eine gesteigerte Transkription der IRG-Gene Irga6 und Irgm3 in vitro statt. Außerdem wurde die Anlagerung von Irga6 auf der PVM in infizierten permanenten SMZ nach IFN γ-Aktivierung bestätigt. Ein IFN-γ-induzierter Parasitenegress aus der Wirtszelle mit anschließendem nekrotischen Zelltod konnte ausgeschlossen werden. Eine Hemmung der IFN-γ-vermittelten Signaltransduktion von NOS2, Irga6 und Irgm3 durch T. gondii besonders in SMZ wurde in hier bestätigt.In dieser Arbeit wird erstmals ein deutlicher Unterschied der IFN-γ-vermittelten Parasitenabwehr zwischen SMZ und Fibroblasten nachgewiesen. Dies unterstreicht eine zentrale Rolle von IFN-γ in der Interaktion von SMZ mit T. gondii, wie sie auch für andere Zelltypen beschrieben wurde. Jedoch scheint IFN-γ in SMZ keine Stadiendifferenzierung vom schnell replizierenden Tachyzoiten zum potentiell persistierenden Bradyzoitenstadium zu induzieren. Da mit konnten in dieser Arbeit wichtige neue Erkenntnisse über die Entwicklung und die Parasitenabwehr von Toxoplasma gondii in Skelettmuskelzellen erzielt werden.Toxoplasma gondii is a widespread intracellular parasite which is able to infect any nucleated cell of warm-blooded animals and humans leading to a lifelong persistence of T. gondii particularly in neuronal and muscular tissue. Although an infection of immunocompetent hosts is mostly asymptomatic, persisting parasites can reactivate in immunosuppressed individuals causing life-threatening diseases including fatal encephalitis. In addition, T. gondii can be transmitted in pregnant women during a primary infection to the unborn child via the placenta leading to severe malformations of the fetus or to abortion. One of the common ways of transmission of Toxoplasma to humans is the ingestion of tissue cysts in raw or undercooked meat from chronically infected livestock. Although the parasite preferentially persists in muscular tissue, until now little is known about the mechanisms that regulate its development, differentiation and persistence within that tissue. The aim of this study was to characterize the development of T. gondii in skeletal muscle. The effect of the proinflammatory cytokines IFN-γ and TNF on the development of the parasite in skeletal muscle was of major interest since both cytokines fulfill crucial roles in the host defence against the parasite and its differentiation. In order to investigate the mechanisms of development of the intracellular parasite on the cellular level, Toxoplasma development was analyzed in permanent C2C12 myoblasts as well as primary murine skeletal muscle cells (SMCs). Both SMC lines were differentiated to myotubes to mimic the situation in differentiated muscular tissue in vivo. The ability of the SMCs to differentiate was confirmed by the detection of muscle-specific markers. A significant anti-parasitic effect of IFN-γ is exerted by SMCs, whereas such effect is clearly lower in control fibroblasts. TNF together with IFN-γ furth er inhibits the parasite growth only in permanent C2C12 SMCs slightly. Notably, stage conversion of Toxoplasma tachyzoites to the dormant bradyzoite stage is diminished by IFN-γ in both SMCs and fibroblasts. Effector mechanisms of the IFN-γ-mediated defense of host cells against T. gondii include the production of cytotoxic nitric oxide (NO) by the inducible nitric oxide synthase (iNOS) which is induced by IFN-γ. In contrast to fibroblasts a clear increase of transcripts of the murine iNOS gene NOS2 was detected in permanent as well as primary SMCs after activation with IFN-γ. An effective NO production after IFN-γ activation of SMCs was confirmed. Importantly, the use of an iNOS inhibitor indicated that iNOS takes part in the defense against T. gondii in SMCs but other mechanisms must be involved as well. Another IFN-γ-mediated effector mechanism is the activation of the IRG-proteins (p47-GTPases). An increased transcription of IRG-genes Irga6 and Irgm3 in vitro takes place particularly in IFN-γ-activated SMCs. Additionally, the deposition of Irga6 protein on the membrane of the parasitophorous vacuole was confirmed in infected permanent SMCs after IFN-γ activation. An IFN-γ-induced egress of the parasite from the host cell and a subsequent necrotic host cell death was excluded. An inhibition of the IFN-γ-mediated signal transduction of NOS2, Irga6 and Irgm3 particularly in SMCs through T. gondii was confirmed. Together, a clear difference in the IFN-γ-mediated defense against T. gondii between SMCs and fibroblasts was demonstrated for the first time in this thesis. This emphasizes the central role of IFN-γ in the interaction of SMCs with T. gondii as it was described earlier in other cell types. However, IFN-γ does not seem to induce differentiation of the fast replicating tachyzoite stage to the pot entially persisting bradyzoite stage. Thus, important new insights in the development and defence against Toxoplasma gondii in skeletal muscle cells were obtained in this study