Strukturelle und funktionelle Untersuchung der Proteinbiosynthese in saccharomyces cerevisiae

Proteinbiosynthese ist ein essentieller Prozess aller Zellen. Sie folgt stets dem gleichen Konzept in allen Organsimen: der genetische Code wird entschlüsselt und transkribiert, die entstandene mRNA wird wiederum in ein Polypeptid translatiert. Dieser Teilprozess wird durch das Ribosom bewerkstelligt. Die Translation umfasst wiederum mehrere Schritte: Initiation, Elongation, Termination und Ribosom Recycling. Diese Teilprozesse unterscheiden sich zum Teil stark voneinander. Ein sehr bedeutender Punkt ist der komplexe Initiationsschritt bei Eukaryonten, der die konzertierte Interaktion von mehreren Proteinen, genannt eukaryontische Initiationsfaktoren (eIF), erfordert. Der grösste Initiationsfaktor, eIF3, setzt sich aus vielen verschiedenen Untereinheiten zusammen. Dieser Komplex dient als Andockhilfe für andere Initiationsfaktoren, die noch binden werden. eIF3 forciert mRNA Rekrutierung und Assemblierung von anderen Initiationsfaktoren an der 40S ribosomalen Untereinheit. Die Komplexizität sowie flexiblen Eigenschaften dieses Faktors verhindert eine einfache Aufreinigung aus Zellen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Protokoll zu etablieren, womit die Aufreinigung von rekombinantem eIF3 aus Saccharomyces cerevisiae möglich ist (siehe Kapitel 2). Zudem sollte die in vitro Assemblierung von recombinant aufgereinigtem eIF3 etabliert werden. Der erhaltene Komplex wurde mit Hilfe von single particle Elektronenmikroskopie auf seine Struktur analysiert. Erste Ergebnisse konnten die Position von eIF3 an der 40S Ribosomuntereinheit zeigen. eIF3 bindet an die zur Lösung hin orientierten Oberfläche. In Kombination mit limitierter Protolyse sowie Massenspektrometrie erlaubte die in vitro Rekonstitution von eIF3 die Analyse der verschiedenen Subkomplexe sowie des Kernkomplexes von eIF3. Zusätzlich konnte durch Fluoreszenzmarkierung von eIF3 eine alternative Strategie aufgezeigt werden, die kinetische Studien während der Initiation und Komplexbildung erlaubt. Eine der grossen Untereinheiten von eIF3, eIF3b/Prt1, dient als Gerüst innerhalb von eIF3 und interagiert mit anderen Untereinheiten. Es beherbergt ein non-kanonisches RNA Recognition Motif (RRM), welches nicht mit Oligonukleotiden interagiert, sondern mit eIF3j/Hcr1, eine sub-stöchiometrische Untereinheit von eIF3. In Kapitel 3 ist die Struktur von eIF3b RRM aus Saccharomyces cerevisiae hochaufgelöst abgebildet. Die Struktur zeigt die gleiche Faltung wie das menschliche Äquivalent. Thermodynamische Analysen der Interaktion zwischen Hefe eIF3b-RRM und eIF3j sowie die Konservierung des Bindemotivs suggerieren, dass sowohl in Hefe als auch im Menschen die gleiche molekulare Interaktion stattfindet. Ein wesentlicher Unterschied zwischen Hefe- und humanem eIF3b-RRM konnte durch Analyse des Ladungszustands der Oberfläche gezeigt werden. Im Gegensatz zu humanem eIF3b-RRM scheint demnach das Hefeprotein sehr wohl in der Lage zu sein, Oligonukleotide zu binden. Bindungsstudien mit total RNA Extrakt aus Hefe konnte diese Hypothese verifizieren: eIF3b-RRM aus Saccharomyces cerevisiae ist in der Lage, RNA zu binden. eIF3j/Hcr1 ist eine lose assoziierte Untereinheit von eIF3 und wurde in der Vergangenheit als Interkationspartner von Rli1 identifiziert, einem Eisen-Schwefel Cluster Protein aus der Superfamilie der ABC ATPasen. Zusätzlich zur Initiation spielt Rli1 eine wichtige Rolle in Ribosomenmaturierung sowie Transport von ribosomalen Untereinheiten in das Cytosol. In Kapitel 4 wird eine neue Funktion von Rli1 in der Translationstermination präsentiert. Es konnte nachgewiesen werden, das Rli1 mit den Terminationsfaktoren eRF1/Sup45 und eRF3/Sup35 aus Saccharomyces cerevisiae interagiert. Mit Hilfe von Deletionsstämmen für Rli1 und sup35-21 oder sup45-2 konnte die Interaktion auf genetischer Ebene gezeigt werden. Zudem konnte ein Zusammenhang zwischen der Runterregulation der Rli1 Expression und der Erkennung von Stopcodons während der Translationstermination nachgewiesen werden. Der gleiche Phänotyp tritt bei Mutationen in Terminationsfaktoren auf, weswegen ein unmittelbarer Zusammenhang bestehen zu scheint. In Kapitel 5 werden die Ergebnisse der verschiedenen Projekte diskutiert. Zudem wird ein breiter Zusammenhang mit dem aktuellen Stand der Forschung erörtert und die Bedeutung der hier vorgestellten Ergebnisse unterstrichen. Ein Ausblick auf naheliegende Projekte sowie Vorschläge für weitere Experimente werden abschliessend in Kapitel 6 ausführlich behandelt.Protein synthesis is an important house-keeping activity of all the cells. It follows the same concepts in all three domains of life: the genetic code is deciphered and transcribed into the mRNA, which in turn is translated into the polypeptide by the help of the ribosome. Translation of proceeds through four steps: initiation, elongation, termination and ribosome recycling. Despite following the same concepts, different steps of translation show certain domain-specificities. One of the hall-marks of eukaryotic initiation, is the complex initiation step, requiring intricate interaction of several protein factors called eukaryotic initiation factors (eIFs). The largest eukaryotic initiation factor, eIF3, is a multi-subunit complex which serves as a scaffold to which other initiation factors bind. It facilitates mRNA recruitment and assembly of other initiation factors on the 40S ribosomal subunit. Its complex and flexible nature hinders its purification for structural and biochemical studies. The major part of the present work, which is presented in chapter two, was to establish a protocol for recombinant purification and in vitro assembly of Saccharomyces cerevisiae eIF3. This complex was subjected to structural studies by single-particle electron microscopy. Initial results were obtained regarding positioning of eIF3 on the 40S subunit, showing its binding to the solvent exposed side of the small ribosome subunit. In vitro reconstitution of eIF3, in combination with Limited proteolysis and mass-spectrometry, allowed the formation and analysis of its different subcomplexes and stable fragments which form the core of eIF3 complex. In addition, fluorescence-labeling of eIF3 introduced new strategy for studying the kinetics of translation initiation and order of complex formation. One of the large subunits of eIF3, eIF3b/Prt1, serves as a scaffold within eIF3 as it interacts with several other subunits. It harbors an RNA Recognition Motif (RRM), which is shown to be a non-canonical RRM in human as it is not capable to interact with oligonucleotides, but rather interacts with eIF3j/Hcr1, a sub-stoichiometric subunit of eIF3. In chapter three, the high-resolution crystal structure of the eIF3b RRM domain from yeast is presented. It exhibits the same fold as its human ortholog. Thermodynamic analysis of the interaction between yeast eIF3b-RRM and eIF3j as well the conservation of the eIF3j binding site between human and yeast eIF3b-RRM suggested that the same mode of interaction between eIF3b and eIF3j in both organisms. However, analysis of the surface charge distribution of the putative RNA-binding â-sheet as well as the conservation of its RNA binding elements, suggested that in contrast to its human ortholog, yeast eIF3b-RRM could potentially bind oligonucleotides. Interaction studies with yeast total RNA extract confirmed the proposed RNA binding activity of yeast eIF3b-RRM. eIF3j/Hcr1, a loosely associated subunit of eIF3 has been previously shown to interact with Rli1, an iron-sulfur-cluster containing member of the super-family of ABC ATPases. In addition to translation initiation, Rli1 plays roles in ribosomal subunit maturation and transport of both ribosomal subunits into the cytoplasm. In chapter four, a novel function for Rli1 in translation termination is presented. Rli1 was shown to physically interact with the translation termination factors eRF1/Sup45 and eRF3/Sup35 in Saccharomyces cerevisiae. Genetic interactions were uncovered between a strain depleted for Rli1 and sup35-21 or sup45-2. Further, down regulation of the RLI1 expression was shown to cause defects in the recognition of a stop codon, as seen in mutants of other termination factors. In chapter five, results obtained from different projects are discussed in a broad perspective. Furthermore, an expansion of the presented data is provided which should shed light on the herein presented results. The future perspective of the projects as well as suggestions for further experiments are presented in chapter six