Mechanistic insights into ribosome recycling and quality control in mRNA translation

Protein biosynthesis is a fundamental process across all domains of life. Polypeptides are produced by translating the genetic information of the messenger RNA (mRNA) into amino acids. This elaborate procedure is divided into the four distinct phases: initiation, elongation, termination, and ribosome recycling. The phases are controlled and regulated by a multitude of translation factors. During initiation, the ribosome assembles on the mRNA. Initiation factors (IFs) bind to the small ribosomal subunit (SSU) and assist the recruitment of mRNA and initiator transfer RNA (tRNA), which delivers the first amino acid methionine. After positioning the SSU at the start codon of the mRNA, additional IFs support the joining of the large ribosomal subunit (LSU). Next, elongation factors (EFs) deliver amino-acylated tRNAs (aa-tRNAs) to the translating ribosome and assist kinetic proofreading and ribosome subunit translocation after the catalytic transfer of the polypeptide onto the aa-tRNA. When a stop codon is reached, translation is terminated by release factors (RFs) that hydrolyze the peptidyl-tRNA to release the nascent protein chain. Afterwards, the ribosome is recycled in Eukaryotes and Archaea by the conserved and essential factor ABCE1, which splits the ribosome into the LSU and SSU. ABCE1 remains bound to the SSU forming the post-splitting complex (post-SC). mRNA translation closes into a cycle by recruitment of IFs to the post-SC and the start of a new round of initiation. The post-SC presents the platform for translation initiation. However, the role of ABCE1 in initiation remains elusive. Therefore, the main goal of my thesis was to unravel the molecular mechanism of ABCE1 on the post-SC and during initiation complex (IC) assembly. Using a reconstituted system, the high-resolution structure of the archaeal post-SC was solved by cryogenic electron microscopy (cryo-EM) following the native splitting route. It was the first complete model of an archaeal SSU at atomic resolution and revealed a previously undescribed ribosomal protein, which we termed eS21. The hinge 2 region of ABCE1 was identified to be the major interaction interface that anchors to the SSU. Functional characterization of single residue mutations in hinge 2 unraveled essential interactions with the ribosomal RNA backbone of the SSU. Sensing of SSU-binding was found to be allosterically transmitted to the nucleotide-binding sites (NBSs) for integration into the ATPase cycle of ABCE1. Reconstitution of the archaeal translation apparatus allowed for dissection of IC assembly in the presence of ABCE1. Three different ICs were resolved by cryo-EM. The results were in accordance with recent structural findings of eukaryotic translation initiation and highlighted that the involvement of ABCE1 is conserved. In a semi-native approach, recombinant ABCE1 was pulled-down from crenarchaeal cell lysates. Mass spectrometric analysis of co-immunoprecipitated ribosomal complexes identified the association of numerous translation factors to the post-SC in a cellular context. The establishment of the genetic toolbox of the acidothermophilic Sulfolobus acidocaldarius allowed the homologous expression of ABCE1. Pull-down of native ABCE1 revealed similar ribosomal complexes as the semi-native and reconstituted approaches. Together, my results gave first physiological relevance of ABCE1 involvement in mRNA translation initiation in Archaea. Native archaeal ABCE1-ICs were vitrified for structural analysis by cryo-EM. Thereby, future structural analysis will allow to analyze the interactions of ABCE1 on native ICs and identify its role in IC assembly. To address the molecular process of IC assembly, the binding affinity of aIF1 to the SSU was determined by fluorescence polarization. Similar studies will allow for a detailed functional analysis on IF recruitment to the SSU in presence of ABCE1. mRNA surveillance and ribosome-associated quality control (RQC) mechanisms evolved to ensure cell viability. The pathways overcome ribosome stalling and defective translation components. Stalled ribosomes are terminated by special RFs, which do not hydrolyze the peptidyl-tRNA, but allow dissociation of the ribosome by ABCE1. Faulty messages are degraded via mRNA decay pathways and the LSU is rescued by RQC factors. Recently, the bacterial RQC factor MutS2 was identified to specifically target collided di- and polysomes but its molecular mechanism remains unknown. In this thesis, initial functional analyses showed tri-phosphate specific nucleotide binding of MutS2. While the dissociation of collided disomes by MutS2 could not be observed, the results pave the way for future in vitro studies of bacterial RQC factors acting on specific ribosome populations. In the future, mRNA translation research must focus on complex quality control processes to comprehensively understand this fundamental cellular process in a holistic context.Die Proteinbiosynthese ist ein grundlegender und essentieller Prozess in allen Domänen des Lebens. Polypeptide werden hergestellt, indem die genetische Information der Boten-RNA (mRNA) in Aminosäureketten übersetzt wird. Dieser komplexe und aufwändige Vorgang gliedert sich in die vier Phasen der mRNA-Translation: Initiation, Elongation, Termination und Ribosomen-Recycling. Sie werden durch eine Vielzahl von Translationsfaktoren gesteuert und reguliert. Während der Initiationsphase wird das Ribosom auf der mRNA zusammengesetzt. Initiationsfaktoren (IFs) binden an die kleine ribosomale Untereinheit (SSU) und helfen bei der Rekrutierung der mRNA und der Initiator-Transfer-RNA, die die erste Aminosäure Methionin liefert (Met tRNAi Met). Eukaryoten (e) und Archaeen (a) verwenden homologe IFs, die einen gemeinsamen strukturellen Kern für den Aufbau des Initiationskomplexes (IC) bilden. So begünstigen a/eIF1 und a/eIF1A die Bindung der mRNA als auch des heterotrimeren Faktors a/eIF2 zur SSU. In Eukaryoten bindet eIF2 zunächst Met tRNAi Met bevor er zum Ribosom rekrutiert wird. In Archaeen hingegen bindet aIF2 zunächst die SSU bevor Mett RNAi Met rekrutiert wird. Nach der Positionierung des Start-Codons fördert a/eIF5B den Zusammenschluss mit der großen ribosomalen Untereinheit (LSU), um das translationsbereite Ribosom zu bilden. Abgesehen von diesen gemeinsamen Kerninitiationsfaktoren, verwenden Eukaryoten zusätzlich den multimeren eIF4, welcher die 58-Kappe und das 38-Poly-Adenosin bindet und durch seine Helikase-Funktion die mRNA für das Ribosom zugänglich macht. Zusätzlich werden die Prozesse am Ribosom während der Initiation sowie zum Teil auch in anderen Translationsphasen durch den Multidomänenfaktor eIF3 unterstützt. Obwohl es den Anschein macht, als würde der Initiationsprozess in Archaeen einer vereinfachten eukaryotischen Variante entsprechen, gibt es nur wenig funktionelle Daten, die den präzisen Ablauf der archaealen Initiation beschreiben. Tatsächlich wird trotz struktureller Parallelen zu Eukaryoten von einem bakteriellen funktionellen Ablauf der Initiation bei Archaeen ausgegangen. In der Elongationsphase liefern Elongationsfaktoren (EFs) die aminoacylierten tRNAs (aa-tRNAs) an das translatierende Ribosom und unterstützen die GTP-abhängige kinetische Korrektur der Codon-Anticodon-Bindung. Nach dem Transfer des Polypeptids auf die korrekte aa-tRNA durch das katalytische Zentrum des Ribosoms, assistieren die EFs die Translokation der ribosomalen Untereinheiten entlang der mRNA. Dieser Prozess setzt sich fort bis ein Stopp-Codon dekodiert wird. Die Translation wird durch Klasse-1 Freisetzungsfaktoren (RFs) mittels Hydrolyse der Peptidyl-tRNA beendet und das gebildete Protein wird freigesetzt. In Eukaryoten und Archaeen wird anschließend das Ribosom durch den essentiellen Recycling-Faktor ABCE1 in seine Untereinheiten gespalten. ABCE1 bindet den terminierten Ribosomenkomplex. Der Einschluss von zwei ATP-Molekülen führt zu drastischen strukturellen Veränderungen von ABCE1. Die Bewegung der ABCE1-Domänen schiebt den RF zwischen die ribosomalen Untereinheiten und bewirkt auf diese Weise die Dissoziation von LSU und SSU. Energetisch betrachtet, ist das ATP-abhängige Ribosomen-Recycling eine Besonderheit, da alle anderen Translationsprozesse GTP-getrieben sind. Nach der Spaltung bleibt ABCE1 stabil an die SSU gebunden und bildet so den Post-Spaltungs-Komplex (Post-SC). Der Prozess der mRNA-Translation schließt sich zu einem Zyklus durch die Rekrutierung von IFs an den Post-SC und dem Beginn einer neuen Translationsrunde. Interessanterweise wurde ABCE1 ursprünglich eine katalytische Funktion während der Initiation zugesprochen, basierend auf Co-Immunpräzipitationen mit IFs in verschiedenen Eukaryoten. Folglich erscheint ABCE1 als zentraler Faktor zwischen Termination und Initiation in der mRNA-Translation. Der Post-SC stellt somit einen zentralen ribosomalen Komplex dar, der als Plattform für die Initiation der Translation fungiert. Nachdem die Funktion von ABCE1 beim Ribosomen-Recycling in den letzten Jahren ausführlich untersucht wurde, blieb die Rolle von ABCE1 während der anschließenden IC-Assemblierung ungeklärt. Daher bestand das Hauptziel dieser Dissertation darin, den molekularen Mechanismus von ABCE1 während der Bildung des Post-SC und des Aufbaus des Initiationskomplexes zu entschlüsseln. Verfügbare schwach- oder intermediär-aufgelöste Strukturen des Post-SCs (in Archaeen und Eukaryoten) konnten bisher die Interaktionsschnittstelle von ABCE1 mit der SSU nicht final aufklären. Entsprechend lag der Fokus auf der strukturellen und funktionellen Analyse des Post-SC..