Analysis of functional complexes of the ribosome in regulation processes and termination

Titelblatt, Inhaltsverzeichnis und Abkürzungen 1\. Einleitung 14 2\. Material und Methoden 37 3\. Ergebnisse 94 4\. Diskussion 178 5\. Literaturverzeichnis und Danksagungen 206Parameter zweier in vitro Systeme zur Analyse der Proteinsynthese in E. coli wurden analysiert und verbessert. Die optimierten Systeme wurden zum Studium ausgesuchter Antibiotika und ihrer Hemmechanismen, sowie zur Funktionsanalyse der Ribosomenfaktoren LepA, RelA und der Terminationsfaktoren RF2 und RRF angewendet. Ferner wurde die toeprint Methode zur Bestimmung der Ribosomenposition auf einer speziell entworfenen mRNA unter in vivo nahen Bedingungen eingeführt. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt: 1\. Wir optimierten unser Standard Poly(U) abhängiges Poly(Phe) System zu einem robusten in vitro System und erzielten statistisch 100 bis 300 eingebaute Phenylalaninreste per Ribosom mit nicht fraktionierten Poly(U) bzw. 800 bis 1000 eingebaute Phenylalaninreste per Ribosom mit Poly(U)-Ketten von 1400 Nukleotiden. Dieses System zeichnet sich durch folgende Merkmale aus: (i) Die Konzentration von 4,5 mM Mg2+ erscheint optimal gemessen an Syntheseleistung und -genauigkeit. (ii) Der hohe Phenylalanin-Einbau erlaubt eine genaue Messung der Fehlerrate mit einer Auflösungsgrenze von 1:10000 (ein Fehleinbau per 10000 eingebauten Phenylalaninen). Das System weist einen Fehleinbau von etwa 1:3000 bezüglich der nah-verwandten Aminosäure Leucin auf, was der in vivo Genauigkeit entspricht. (iii) Signifikanten Fehleinbau konnten nur für Fehlpaarungen in der wobble Position des Codons (dritte Codonposition), jedoch nicht in der mittleren Position und kaum in der ersten Position des A-Stellen Codons beobachtet werden. Dies gilt auch dann, wenn der Fehleinbau um einen Faktor von 20 bis 30 durch Streptomycin oder durch eine Erhöhung der Mg2+-Konzentration verstärkt wurde. Diese Beobachtung führte zu einer genaueren Definition der Begriffe kognat, nah-kognat und nicht-kognat über die Wahrscheinlichkeit des Fehleinbaus und die damit gekoppelten dramatischen Unterschiede in dem GTP Verbrauch, im Gegensatz zu der bisher vorherrschenden, zu simplen Betrachtung der Fehlpaarungen (Szaflarski und Vesper et al. Publikation in Vorbereitung). Des weiteren konnten wir in diesem System ein nicht-enzymatisches Recycling der Ribosomen nachweisen und eine Recyclingzeit von ca. 300 Sekunden bestimmen. 2\. Die Einführung der toeprint Methode in den Methodenpool der Arbeitsgruppe war - in Kombination mit der Puromycinreaktion entscheidend für die Entdeckung einer neuen ribosomalen Funktion eines in unserer Gruppe entdeckten ribosomalen Elongationsfaktors, des Proteins LepA, welches zu den konserviertesten Proteinen überhaupt gehört und den wir vorschlagen EF4 zu nennen. Die neue Funktion von EF4 ist überraschenderweise eine Rücktranslokation der tRNAs von E- und P- Stellen in die P- und A- Stellen während der Elongation, was offenbar zur Steigerung der Genauigkeit der Proteinsynthese unter Stressbedingungen von großer Bedeutung ist. Das konnten wir in zwei verschiedenen gekoppelten Transkriptions-/Translationssystemen belegen. 3\. Widersprüchliche Daten zu den bekannten Aminoglykosid-Effekten auf die A-Stellen Besetzung konnten aufgelöst werden. Insbesondere haben wir festgestellt, dass einige Aminoglykoside eine Rücktranslokation des Ribosoms auslösen können (jedoch nicht das Aminoglykosid Hygromycin), während andere, nicht-verwandte Antibitotika wie Viomycin und Edein ebenfalls einen starken Rücktranslokationseffekt aufweisen. 4\. Für Pilotexperimente zur Analyse der Termination und des Ribosomenrecyclings konnten in vitro Systeme etabliert werden. Der wichtigste Befund war, dass die E-tRNA Entlassung durch die Terminationsfaktoren der Klasse 1 (hier RF2) und nicht durch RRF, ein Faktor der Klasse 2, ausgelöst wird, eine Fragestellung, die bislang nicht bearbeitet werden konnte.Parameters of two in vitro systems for the analysis of protein synthesis in E. coli were analyzed and improved. The optimized systems were applied for a study of selected antibiotics and their inhibition mechanisms, and in addition for the functional analysis of ribosomal factors LepA, RelA and the termination factors RF2 and RRF. Eventually, the toeprint method for the determination of the ribosome position on specifically designed mRNAs was introduced under in vivo near conditions. The following results were achieved: 1: We optimized our standard poly(U) dependent poly(Phe) system achieving a robust system with statistically 100 to 300 incorporated Phe residue per ribosome with non-fractionated poly(U) and 800 to 1.000 Phe per ribosome with poly(U) chains of 1.400 nucleotides. This system is characterized by the following features: (i) The concentration of 4.5 mM Mg2+ represents an optimum concerning both rate and accuracy. (ii) The high Phe incorporation allows a precise assessment of the mis-incorporation rate with a resolution limit of 1:10,000 (one mis-incorporated amino acid per 10,000 incorporated Phe). The system shows a misreading of 1:3,000 concerning the near-cognate amino acid Leu, which corresponds nicely to the in vivo accuracy. (iii) A significant mis-incorporation was observed only at a mis-reading of the codon- wobble position (third Codonposition), rather than at the middle position and hardly at the first position of the A-site codon. This is also true, when the mis- incorporation was boostered 20- to 30-fold by streptomycin or an increase of the Mg2+ concentration, respectively. This observation led to an improved definition of the terms cognate, near-cognate and non-cognate via the probability of mis-incorporation including the coupled and dramatically different GTP consumption, in contrast to the prevailing and too simple consideration of the mis-pairings (Szaflarski and Vesper et al., publication in preparation. Furthermore, a non-enzymatic recycling of ribosomes with a recycling time of about 300 sec was observed. 2: The introduction of the toeprint method in our group was together with the puromycin reaction instrumental for the detection of a new ribosomal function of an elongation factor, the protein LepA, which was detected in our group. This protein belongs to one of the most conserved proteins known, and we suggest to call it EF4 . The new function of Ef4 is surprisingly a back-translocation of tRNAs form the E and P sites to the P and A sites, respectively. This seems to be important for an increase of the accuracy of protein synthesis under stress conditions. This we could confirm in two different coupled transcription- translation systems. 3: Controversial data of known aminoglycoside effects on the A-site occupation could be resolved. In particular, we demonstrated a back-translocation of some but not all aminoglycosides, and also non-related antibiotics such as viomycin and edeine were found to be strong back- translocators. 4: We established in vitro systems for pilot experiments concerning termination and ribosome-recycling. The most important result was that the E-tRNA release was triggered by the termination factors of class I (here RF2) rather than RRF, a factor of class 2. This issue could not hitherto be analyzed