Characterization of the TRIM37 gene and mutations underlying mulibrey nanism

Mulibrey nanism is a hereditary developmental disorder, characterized by prenatal onset growth failure without postnatal catch-up growth, distinctive craniofacial features, progressive cardiopathy and failure of sexual maturation. In addition, the patients develop insulin resistance syndrome and type 2 diabetes and they have an increased risk of developing tumors. The TRIM37 gene that underlies mulibrey nanism encodes for a member of the tripartite motif (TRIM) protein family. The physiological function of TRIM37 and the pathogenetic mechanisms leading from TRIM37 dysfunction to the mulibrey nanism phenotype are unknown. However, TRIM37 localizes at least partially to peroxisomes, and possesses ubiquitin E3-ligase activity. Thus, it may mediate ubiquitin dependent protein degradation, suggesting that accumulation of yet unknown substrate proteins may underlie the disease pathogenesis. In this study, the TRIM37 gene was characterized in detail. A transcription initiation window, with several separate transcription start sites, was identified and the putative promoter region immediately upstream from the transcription initiation window was shown to possess basal promoter activity. Further, several alternative splice variants of the gene were identified, including a highly expressed testis specific variant, encoding for an identical protein product with the main transcript. Expression of TRIM37 mRNA was detected in several different tissues, with highest expression seen in testis and in brain, when the expression patterns of the two major transcripts in different human tissues were studied by quantitative real-time PCR. Several mulibrey nanism patients were studied and thirteen novel mutations in TRIM37 were found, including three mutations (p.Gly322Val, p.Cys109Ser, p.Glu271_Ser287), that are likely to express mutant TRIM37 proteins. These mutations were further shown to alter the subcellular localization of the mutant proteins. Most of the mulibrey nanism associated mutations however, lead to premature termination codons and degradation of mRNA. All the TRIM37 mutations identified to date predict loss-of-function alleles, and thus no phenotype-genotype correlation is seen among the patients. In order to understand the pathogenetic mechanisms underlying mulibrey nanism, an animal model for the disorder is needed. For the development of a Trim37 knock-out mouse, the mouse Trim37 gene was characterized. Alternative splice variants, were identified, including a testis specific variant predicting a longer protein product. Further, a strictly tissue and cell-specific pattern of Trim37 expression was observed in developing and adult mouse tissues, when studied by immunohistochemical methods. This distribution of Trim37 expression in mouse tissues is in agreement with the clinical findings in human mulibrey nanism patients. This thesis work gives new tools for the diagnostics of mulibrey nanism as well as for studying the molecular pathogenesis behind this interesting disorder.Mulibrey nanismi on harvinainen monioireinen synnynnäinen sairaus, jonka oireisiin kuuluvat jo sikiökaudella alkava kasvuhäiriö, tyypilliset kolmiomaiset kasvonpiirteet sekä etenevä sydänairaus. Useille potilaille kehittyy lisäksi metabolinen oireyhtymä ja tyyppi kahden diabetes, ja heillä on suurentunut alttius lapsuusajan munuaiskasvaimiin sekä hyvänlaatuisiin munasarjakasvaimiin. Mulibrey nanismin taustalla ovat virheet TRIM37-geenissä. Geenin tuottaman TRIM37-proteiinin normaali toiminta ja mulibrey nanism tautimekanismit ovat vielä toistaiseksi tuntemattomia. Alustavat tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet proteiinin paikantuvan solunsisällä peroksisomeihin ja TRIM37-proteiinilla on osoitettu olevan ubikitiini-ligaasiaktiivisuutta. Nämä löydökset viittaavat siihen että TRIM37-proteiinin toiminta saattaa liittyä proteasomi-välitteiseen proteiinien hajotukseen. Tässä väitöskirjatyössä on kuvattu ihmisen ja hiiren TRIM37-geenin rakenne, tutkittu geenin ilmenemistä ihmisen ja hiiren kudoksissa, sekä tunnistettu potilailla esiintyviä mulibrey nanismia aiheuttavia mutaatioita ja tutkittu niiden vaikutusta proteiinin solunsisäiseen paikantumiseen ja ligaasiaktiivisuuteen. Tulostemme perusteella TRIM37 geenin ja proteiinin ilmenemistä säädellään usealla eri tasolla. Suurin osa mulibrey nanismia aiheuttavista mutaatioista johtaa ennenaikaisten lopetuskodonien syntymiseen ja näin ollen todennäköisesti mRNAn hajotukseen jo ennen proteiinituotteen syntymistä. Tästä johtuen potilassoluissa tuotetaan vain joko hyvin vähän, tai ei lainkaan TRIM37-proteiinia. Tässä työssä tunnistetuista kolmestatoista uudesta mutaatiosta, kymmenen johtaa ennenaikaisen lopetuskodonin syntymiseen ja kolme johtaa virheellisen proteiinin syntymiseen. Nämä virheelliset proteiinit säilyttävät ligaasiaktiivisuutensa, mutta eivät enää paikannu peroksisomeihin, kuten normaali TRIM37-proteiini. Uusien potilasmutaatioiden tunnistaminen mahdollistaa molekyyligeneettisen diagnostiikan ja sikiödiagnostiikan perheissä, joissa mulibrey nanismia esiintyy. Virheellisten ja toimimattomien proteiinien tunnistaminen voi myös osaltaan auttaa ymmärtämään TRIM37-proteiinin normaalia toimintaa ja mulibrey nanismin syntymekanismeja. Tätä tavoitetta tukee myös geenin rakenteen tunteminen ja geenin säätelytekijöiden tunnistaminen ja kuvaaminen. Hiiren Trim37-geeni on hyvin homologinen ihmisen geenin kanssa. Trim37-proteiinin ilmeneminen hiiren kudoksissa on sopusoinnussa mulibrey nanismi potilaiden oireiden kanssa. Proteiinia ilmenee useissa eri kudoksissa, mutta ilmeneminen on hyvin soluspesifistä. Hiiren geenin luonnehtiminen ja Trim37-geenin ilmenemisen kartoitus hiiren kudoksissa luo pohjaa myös Trim37-poistogeenisen hiirikannan luomiselle eläinmalliksi mulibrey nanismille