Aberrant kinase activation as a therapy target : Chronic myeloid leukemia as a model disease

Chronic myeloid leukemia (CML) is a hematologic malignancy that originates from pluripotent hematopoietic stem cells. The genetic abnormality underlying this disease, as well as a subtype of acute lymphoblastic leukemia (ALL), is a translocation between chromosomes 9 and 22, which leads to the formation of the Philadelphia (Ph) chromosome and the oncogenic BCR-ABL1 fusion protein. Targeted inhibition of the BCR-ABL1 protein with imatinib and other specific tyrosine kinase inhibitors (TKIs) has revolutionized CML treatment and is currently regarded as the gold standard of targeted cancer therapy. In this doctoral thesis, different methodological approaches were used to characterize aberrant signaling activities in leukemic and normal cells with the ultimate aim of isolating novel prognostic markers for predicting TKI therapy outcome. First, the molecular mechanism of the disease was investigated in an ALL patient with a translocation between chromosomes 1 and 9. Cytogenetic characterization showed involvement of the ABL1 gene fused to an unknown gene. The RCSD1 gene was selected as a candidate and subsequent molecular dissection confirmed a RCSD1-ABL1 fusion. This novel fusion gene predicts sensitivity to TKI therapy in ALL patients. Second, several phosphoproteins related to immune cell function were analyzed both from the diagnostic phase CML patients and from patients under TKI therapy in order to reveal distinct signaling patterns. A single cell phosphoprotein method based on multiparameter flow cytometry was used to analyze phosphoprotein levels in different cell populations. The responsiveness of myeloid cells to ex vivo cytokine stimulation in diagnostic-phase patients was low, but was normalized in TKI-treated patients. In general, the blood leukocyte subsets responded normally to various cytokine stimulations, which indicated a non-immunosuppressive role for TKIs. This project also led to the development of a software assisted analysis program, which can conduct the whole range of flow cytometry data analysis, thereby diminishing the effort needed for manual cell population gating and interpretation. Lastly, biomarkers for therapy response were identified by analyzing aberrant signaling activities in leukemic cells collected at the time of diagnosis. The analysis was based on a phosphoproteomic array measuring phosphorylation of 46 different kinase targets. Several proteins had aberrant phosphorylation levels in patients with a poor therapy outcome − pSTAT5b being the most prominent. These biomarkers could be useful in guiding therapy selection at the time of diagnosis. In conclusion, the findings imply that TKI therapy responses can be linked to certain biological markers, which can possibly be utilized in clinical applications in the future.Krooninen myelooinen leukemia (KML) on pahanlaatuinen verisairaus, joka saa alkunsa luuytimen kantasolun perimän muutoksesta. Muutoksen seurauksena syntyy Philadelphia-kromosomi (Ph), jonka ohjaamana syntyy aktiivisuudeltaan epänormaalia BCR-ABL1 tyrosiinikinaasia, mikä johtaa myelooisen sarjan verisolujen hallitsemattomaan lisääntymiseen. Ph-kromosomi on havaittavissa myös osalla akuuttia lymfaattista leukemiaa (ALL) sairastavilla potilailla. Nykyään KML:n hoitona käytetään tyrosiinikinaasiestäjiä (TKE), kuten imatinibia, joiden vaikutus kohdentuu spesifisesti BCR-ABL1-proteiiniin. Kyseiset lääkkeet saavat aikaan hyvän hoitovasteen suurimmalla osalla potilaista. Osalla potilaista ongelmana on kuitenkin vasteen puuttuminen tai resistenssin kehittyminen. Tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää biologisia mittavälineitä, joiden avulla voitaisiin ennustaa hoitovastetta TKE-lääkitykselle sekä ohjata sopivan lääkityksen valitsemista. Tutkimuksen ensimmäisessä osassa selvitettiin Ph-negatiivisen ALL potilaan taudin molekulaarista mekanismia, koska potilas oli saanut hoitovasteen TKE-lääkitykselle. Taudin taustalta löytyi uudenlainen RCSD1-ABL1 geeni, jota voidaan tulevaisuudessa hyödyntää ALL-potilaiden taudin karakterisoinnissa ja oikeanlaisen lääkityksen valitsemisessa. Toisessa osatyössä tutkittiin TKE-lääkkeiden vaikutusta KML-potilaiden immuunijärjestelmän toimintaan määrittämällä solunsisäiseen viestintään osallistuvien signaalimolekyylien aktiivisuuksia virtaussytometrisellä menetelmällä. Havaintona oli, että diagnoosivaiheessa potilaiden tietyt valkosolut eivät reagoi kasvutekijään, mutta TKE-lääkityksen aikana reagointi oli normaalia, mistä voidaan päätellä etteivät TKE-lääkkeet haittaa potilaiden immuniteettia. Tämän työn pohjalta kehitettiin myös automaattinen tietokoneohjelmisto virtaussytometriadatan käsittelyyn. Viimeisessä osassa määritettiin KML-potilaiden luuytimistä solunsisäisten signaalimolekyylien aktiivisuuksia, joista osan todettiin korreloivan potilaiden hoitovasteiden kanssa. Näiden molekyylien aktiivisuuksia voidaan mahdollisesti hyödyntää oikeanlaisen TKE-lääkityksen valitsemisessa KML-potilaille. Yhteenvetona voidaan todeta, että TKE-lääkitykseen liittyvät hoitovasteet voidaan yhdistää tietynlaisiin biologisiin mittareihin, jotka antavat mahdollisuuden potilaiden lääkityksen suunnitteluun ja hoitovasteen ennustamiseen