Biochemische Charakterisierung von Photosystem-I-Komplexen aus Diatomeen

Photosystem (PS) I is a huge membrane protein complex which coordinates around 200 co-factors. Upon light excitation a charge separation at the PS I reaction centre is induced which leads to an electron transport across the thylakoid membrane and the generation of redox equivalents needed for several biochemical reactions, e.g. the synthesis of sugars. For higher plants and cyanobacteria the crystal structure of PS I complexes were resolved to resolutions of 4.4 Å and 2.5 Å. Furthermore, supramolecular structures of PS I of eukaryotic algae, mainly of the green line, were obtained recently. However, up to now, no structure of diatoms is available yet. Diatoms are key players in global primary production and derived from a secondary endosymbiosis event. Their chloroplasts are surrounded by four envelope membranes and their thylakoids are evenly arranged in bands of three, i.e. no separation in grana and stroma regions is apparent. In this thesis a protocol was developed to isolate a functional PS I complex of diatoms which can be used for structural analysis by transmissional electron microscopy (TEM). A photosystem I-fucoxanthin chlorophyll protein (PS I-FCP) complex was isolated from the pennate diatom Phaeodactylum tricornutum by ion exchange chromatography. Spectroscopic analysis proved that bound Fcp polypeptides function as a light-harvesting complex. An active light energy transfer from Fcp associated pigments, Chl c and fucoxanthin, towards the PS I core was proven by fluorescence spectroscopy. Oxidised minus reduced difference spectroscopy evidenced the activity of the PS I reaction centre P700 and yielded a chlorophyll a/P700 ratio of approximately 200:1. These data indicate that the isolated PS I-FCP complex exceeds the PS I cores from cyanobacteria and higher plants in the numbers of chlorophyll a molecules. Because of the strict conservation of PS I cores among organisms the additional 100 chlorophyll a molecules must either be coordinated by Fcps or function as linker molecules between the Fcp antenna and the PS I core as shown for the PS I-LHC I complex of higher plants. To tell something about the structural organisation, the PS I-FCP complex was compared with its cyanobacterial and higher plant counterparts. Whereas cyanobacterial PS I cores aggregate to trimers, usually without associated antennae, higher plant PS I is a monomer and binds additionally two LHC I heterodimers. BN-PAGE and gel filtration experiments showed that also diatoms contain PS I monomers associated with Fcps as light-harvesting antenna. First TEM studies evidenced these observations. Negatively stained PS I-FCP particles had an increased size compared to PS I cores of other organisms. No PS I trimers or higher oligomers have been found. The calculated diameter and shape of the particles correspond to PS I-LHC I particles obtained from green algae, which also comprise of a higher number of LHC I polypeptides compared to the higher plant x-ray structure. Additionally, the analysis of polypeptides indicates that the PS I associated Fcps differ from the free Fcp pool and also from Fcps of a PS II enriched fraction. The assumption that diatoms harbour just one Fcp antenna that serve both Photosystems equally seems to be wrong. To further study the association of Fcps with the two Photosystems, both complexes plus the free FCP complexes were isolated from the centric diatom Cyclotella meneghiniana. Because of the availability of antibodies directed against specific Fcp polypeptides of Cyclotella the PS I-FCP complex of Phaeodactylum could not be used. A trimeric FCP complex, FCPa, and a higher FCP oligomer, FCPb, have already been described for C. meneghiniana. The latter is assumed to be composed of only Fcp5, whereas the FCPa contains Fcp2 and Fcp6. Biochemical and spectroscopical evidences revealed a different subset of associated Fcp polypeptides within the isolated photosystem complexes. Whereas the PS II associated Fcp antenna resembles FCPa, at least three different Fcp polypeptides are associated with PS I. By re-solubilisation of the PS I complex and a further purification step Fcp polypeptides were partially removed from PS I and both fractions were analysed again by biochemical and spectroscopical means, as well as by HPLC. Thereby Fcp4 and a so far undescribed 17 kDa Fcp were found to be strongly coupled to PS I, whereas another Fcp, presumably Fcp5, is only loosely bound to the PS I core. Thus an association of FCPb and PS I is assumed.Bei Photosystem (PS) I handelt es sich um einen großen Membranproteinkomplex, welcher ca. 200 Cofaktoren koordiniert. Die Anregung mit Licht verursacht eine Ladungstrennung am Reaktionszentrum von PS I die zu einem Elektronentransport über die Thylakoidmembran führt und letztendlich Redoxäquivalente generiert. Die Struktur von PS I Komplexen höherer Pflanzen sowie Cyanobakterien wurden mit Auflösungen von 4.4 Å bzw. 2.5 Å durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Bis heute liegen keinerlei Strukturen von photosynthetischen Membranproteinkomplexen aus Diatomeen vor. Diatomeen nehmen eine Schlüsselrolle in der globalen Primärproduktion ein und entstanden durch sekundäre Endosymbiose. Dabei wurden Verwandte der heutigen Rotalgen von einem unbekannten eukaryotischen Einzeller aufgenommen. Die Chloroplasten der Diatomeen sind infolgedessen von vier Membranen umschlossen. Ihre Thylakoide sind gleichmäßig in Form von Dreierbändern organisiert, d.h. es werden keine Grana- und Stromaregionen ausgebildet. Ziel dieser Arbeit war es, ein Protokoll zu entwickeln, welches die Isolierung eines funktionsfähigen PS I Komplexes aus Diatomeen ermöglicht und der für die Strukturanalyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) geeignet ist. Mittels Ionenaustauschchromatographie wurde ein Komplex aus PS I und Fucoxanthin-Chlorophyll bindenden Proteinen (PS I-FCP Komplex) aus der pennaten Diatomee Phaeodactylum tricornutum gereinigt. Spektroskopische Analysen wiesen auf die Funktion der Fcps als funktioneller Lichtsammelkomplex für PS I hin. Aktiver Energietransfer von Fcp assoziierten Pigmenten, wie Fucoxanthin und Chlorophyll c, zum PS I Reaktionszentrum konnte durch Fluoreszenzspektroskopie nachgewiesen werden. Weiterhin bestätigten differenzspektroskopische Messungen von oxidierten minus reduzierten Proben die Aktivität des P700 Reaktionszentrums. Zudem konnte ein Verhältnis von 200 Chlorophyll a Molekülen pro Reaktionszentrum ermittelt werden. Im Vergleich zu monomeren PS I-Core Komplexen aus Cyanobakterien oder höheren Pflanzen (etwa 100:1) deutet dieses Verhältnis auf eine höhere Anzahl von Chlorophyll a im PS I-FCP Komplex von Diatomeen hin. Da die Grundstruktur von PS I stark konserviert ist, werden die ca. 100 zusätzlichen Chlorophylle entweder von den gebundenen Fcps koordiniert oder sie fungieren als Verbindungschlorophylle zwischen der Fcp Antenne und dem PS I Core, ähnlich den Verbindungschlorophyllen zwischen dem LHC I und dem PS I-Core höherer Pflanzen. Um etwas über den strukturellen Aufbau des PS I-FCP Komplexes zu erfahren, fand ein Vergleich mit den entsprechenden Komplexen aus Cyanobakterien und höheren Pflanzen statt. Die Methoden der Wahl waren hierbei BN-PAGE sowie Gelfiltrationsexperimente. Während PS I in Cyanobakterien Trimere ausbildet, welche üblicherweise keine weiteren Lichtsammelkomplexe binden, liegt in höheren Pflanzen ein PS I Monomer assoziiert mit zwei Heterodimeren LHC I Komplexen vor. Die Vergleiche zeigten, dass PS I in Diatomeen ebenfalls als Monomer vorliegt und mit Fcp Lichtsammelkomplexen assoziiert ist. Erste TEM Studien bestätigten diese Beobachtungen. Negativ kontrastierte PS I-FCP Partikel deuteten darauf hin, daß PS I-Cores anderer Organismen eine geringere Größe aufweisen. Keine PS I Trimere oder gar höhere Oligomere wurden beobachtet. Der berechnete Durchmesser und die Form der PS I-FCP Partikel ähnelten PS I-LHC I Partikel aus Grünalgen. Letztere weisen im Vergleich zu der PS I-LHC I Struktur höherer Pflanzen ebenfalls eine höhere Anzahl an gebundenen LHC I Proteinen auf. Zusätzlich deutete die Untersuchung der Polypeptide darauf hin, daß sich die PS I assoziierten Fcps von ungebundenen Fcps sowie Fcps einer PS II angereicherten Fraktion unterscheiden. Aus diesem Grund erscheint die Annahme falsch, dass Diatomeen über eine einzige Fcp Antenne verfügen, die sowohl für PS I und PS II gleichermaßen die Funktion als Lichtsammelkomplex übernimmt. Um die Assoziation von Fcps mit den zwei Photosystemen zu untersuchen, wurden PS I- und PS II-Komplexe sowie ungebundene FCP Komplexe aus der zentrischen Diatomee Cyclotella meneghiniana isoliert. Aufgrund der Tatsache, daß spezifische Cyclotella Fcp Antikörper zur Verfügung standen, konnte der PS I-FCP Komplex aus P. tricornutum nicht verwendet werden. Trimere, sogenannte FCPa Komplexe sowie höhere FCPb Oligomere wurden für C. meneghiniana bereits beschrieben. Während der letztere vermutlich ausschließlich aus Fcp5 zusammengesetzt ist, besteht der FCPa Komplex zumindest aus Fcp2 und Fcp6 Untereinheiten. Spektroskopische und biochemische Nachweismethoden zeigten, daß unterschiedliche Fcp Polypeptide mit den zwei Photosystemen assoziiert sind. Die PS II assoziierten Fcps entsprechen den Eigenschaften und dem Aufbau des FCPa Komplexes, während PS I mindestens drei unterschiedliche Fcp Polypeptide bindet. Demnach scheinen Fcp4 sowie ein bislang unbekanntes 17 kDa Fcp Polypeptid relativ stark mit PS I gekoppelt zu sein