Increasing structural diversity by prenylation-based modifications

Fungi have the ability to generate tremendously complex and diverse natural products. Fungal secondary metabolites are highly relevant in mankind’s daily life by playing an important role in medicine, agriculture and manufacturing industries. Since the discovery of antibiotics in the first half of the last century, an enormous variety of natural products has been discovered in different fungi. With the advent of the genomics revolution, scientists have realized that the remarkable chemical space of fungal secondary metabolites has resulted from the diversification of biosynthetic gene clusters (BGC). Enzymes as efficient catalysts are the bridge between these biosynthetic genes and the resulting small molecules. The initial chemical scaffolds are assembled by backbone enzyme(s) and undergo decorations catalysed by a set of tailoring enzymes to mature the products. Prenyltransferases are one representative family of these tailoring enzymes. “Aromatic” prenyltransferases accept a broad spectrum of substrates including, but no limited to, indole derivatives, benzene carbaldehydes and naphthalenes. Prenylated metabolites can be further modified by enzymatic or nonenzymatic reactions to facilitate the functional group density. Thus, understanding the complexity and diversity of natural product scaffolds requires investigation of whole biosynthetic assembly lines in vivo as well as the participating enzymes and their mechanisms. There are substantial studies demonstrating the diversification of enzymatic post-modifications on prenyl moieties. For example, the nonheme FeII/2-oxoglutarate (2-OG)-dependent oxygenase FtmOx1 from Aspergillus fumigatus is involved in the biosynthesis of fumitremorgin-type mycotoxins and catalyses an endoperoxide formation by insertion of an oxygen molecule into two prenyl moieties. Following this work, we cloned and overexpressed its homologous gene NFIA_045530 from Neosartorya fischeri. The recombinant protein EAW25734 encoded by NFIA_045530 was purified to apparent homogeneity and incubated with intermediates of the fumitremorgin biosynthetic pathway. LC-MS analysis revealed no consumption of fumitremorgin B, the natural substrate of FtmOx1, but good conversion with its biosynthetic precursor tryprostatin B in the presence of FeII and 2-OG. Structure elucidation confirmed the three products as 22-hydroxylisotryprostatin B, 14a-hydroxylisotryprostatin B and 14a, 22-dihydroxylisotryprostatin B. Further detailed biochemical characterization proved EAW25734 to be a nonheme FeII/2-OG-dependent oxygenase, which catalyses a double bond migration within the dimethylallyl moiety accompanied by hydroxylation. We proposed that the reaction mechanism for this transformation is a radical rearrangement prior to accepting a hydroxyl radical from FeIII. The major origin of the hydroxyl groups at C14a and C22 was confirmed to be O2 by labelling experiments. Solvent exchange was also observed for that at C22. LC-MS analysis of the fungal culture revealed the presence of 22-hydroxylisotryprostatin B, indicating the hijacking of tryprostatin B by EAW25734 from the fumitremorgin pathway. Our study demonstrates a notable oxidative modification of prenyl moieties. In cooperation with Dr. Jinglin Wang, we investigated spontaneous rearrangements of 4-dimethylallyl-1,3-dihydroxynaphthalene to two tetrahydrobenzofuran and one bicyclo[3.3.1]nonane derivatives. Incubations of FgaPT2, 1,3-dihydroxynaphthalene and DMAPP under 18O2-enriched atmosphere and with 18O-enriched water confirmed that the two additional hydroxyl groups were originated from one molecule of O2. Thus, a radical-involved mechanism was proposed starting with a reactive C4-peroxyl intermediate, which led to radical shifts and the formation of tricyclic products. These results provide one additional example for the nonenzymatic oxidative cyclisation and give valuable insights into the structural diversification by spontaneous reactions. In cooperation with Jonas Nies, a nine-gene fog cluster was identified in Aspergillus ruber. Genome mining revealed the presence of a prenyltransferase gene fogH in the fog cluster. The involvement of the fog cluster in the biosynthesis of the prenylated salicylaldehyde flavoglaucin and congeners was confirmed by heterologous expression of the whole cluster in Aspergillus nidulans. The highly-reducing polyketide synthase FogA, together with three additional enzymes, was proven to be responsible for the formation of the benzyl alcohol intermediates. Deletion of fogH led to the accumulation of C5-hydroxylated hydroquinones, which were unstable and partially oxidised to their benzoquinone forms. Biochemical characterization revealed that the prenyltransferase FogH can accept both hydroquinone and benzoquinone forms as substrates. Consecutively, the alcohols were oxidized to the final aldehyde products by an oxidase, which only accepts prenylated derivatives as substrates. Meanwhile, the spontaneous oxidoreduction from prenylated benzoquinone alcohols to final hydroquinone aldehydes was observed as a minor side reaction during isolation. Therefore, this study demonstrated a highly efficient and programmed biosynthetic machinery for the flavoglaucin formation and highlighted the importance of the prenyltransferase FogH in the assembly line. In the review on fungal benzene carbaldehydes, we summarised their structural features, distribution, biological activities and biosynthesis with focus on alkylated derivatives and meroterpenoids. The first group carries different alkyl chains (C3, C5, C7, C9 or C11) at the ortho-position to the aldehyde group and the second group contains structural features derived from a C5, C10 or C15 prenyl moiety. In addition, simple benzaldehydes, benzophenones, spirocyclic and other benzene carbaldehydes were also included. Most of the reviewed compounds are salicylaldehyde derivatives, which are assembled by polyketide synthases from ascomycetes and released directly as aldehydes or afterwards oxidised/reduced by tailoring enzymes.Pilze besitzen die Fähigkeit hoch komplexe und diverse Naturstoffe zu produzieren. Pilzliche Sekundärmetabolite sind von hoher Relevanz im täglichen Leben von Menschen und spielen eine wichtige Rolle in Medizin, Landwirtschaft und Industrie. Seit der Entdeckung der Antibiotika in der ersten Hälfte des letzten Jahrhunderts wurde eine Vielzahl von verschiedenen Naturstoffen aus Pilzen isoliert. Mit dem Aufkommen der genomischen Revolution wurde es für Wissenschaftler deutlich, dass die bemerkenswerte Varianz und Vielfalt der pilzlichen Sekundärmetabolite aus der Diversifizierung von biosynthetischen Genclustern (BGCs) resultiert. Enzyme, als effiziente Katalysatoren, bilden die Brücke zwischen diesen Genen und den resultierenden niedermolekularen Verbindungen. Die anfänglichen Grundgerüste werden durch sogenannte „Backbone“-Enzyme konstruiert und durch weitere Enzyme zu den jeweiligen Endprodukten modifiziert. Ein Vertreter dieser modifizierenden Enzyme ist die Prenyltransferase. „Aromatische“ Prenyltransferasen akzeptieren diverse Substrate, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Indolderivate, Benzaldehyde und Naphthaline. Prenylierte Metabolite können durch enzymatische oder nichtenzymatische Reaktionen weiter modifiziert werden, um die Vielfalt der funktionellen Gruppen zu erhöhen. Um die Komplexität und strukturelle Vielfalt von Naturstoffen zu verstehen, sind daher Untersuchungen der gesamten Biosynthesewege, sowie der beteiligten Enzyme und ihrer Mechanismen erforderlich. Es gibt umfangreiche Studien, die die Diversifizierung enzymatischer Postmodifikationen an Prenyleinheiten demonstrieren. Die nicht-Häm-FeII / 2-Oxoglutarat (2-OG) abhängige Oxygenase FtmOx1 aus Aspergillus fumigatus ist, z.B. an der Biosynthese der Mykotoxine vom Fumitremorgin-Typ beteiligt und katalysiert die Bildung eines Endoperoxids durch Insertion eines Sauerstoffmoleküls zwischen zwei Prenylresten. Darauf aufbauend haben wir ein homologes Gen NFIA_045530 aus Neosartorya fischeri kloniert und überexprimiert. Das von NFIA_045530 kodierte rekombinante Protein EAW25734 wurde zur Homogenität gereinigt und mit den Intermediaten des Fumitremorgin-Biosynthesewegs inkubiert. Die LC-MS Analyse zeigte keinen Umsatz von Fumitremorgin B, dem natürlichen Substrat von FtmOx1, allerdings aber einen guten Umsatz mit seinem Vorstufe Tryprostatin B in Anwesenheit von FeII und 2-OG. Die Strukturaufklärung bestätigte die drei Produkte als 22-Hydroxylisotryprostatin B, 14- Hydroxylisotryprostatin B und 14,22-Dihydroxylisotryprostatin B. Detaillierte biochemische Untersuchungen zeigten, dass die nicht-Häm-FeII / 2-Oxoglutarat abhängige Oxygenase EAW25734 die Doppelbindungsverschiebung innerhalb der Dimethylallyl-Einheit und gleichzeitige Hydroxylierung katalysiert. Als Reaktionsmechanismus haben wir eine radikale Umlagerung vorgeschlagen, bevor ein an das FeIII gebundene Hydroxylradikal übertragen wird. Durch Markierungsexperimente wurde bestätigt, dass der Sauerstoff an C14a und C22 hauptsächlich aus O2 stammt. Für C22-OH wurde ein Austausch des Sauerstoffs mit H2O nachgewiesen. LC-MS Analyse der Pilzkultur bestätigte das Vorhandensein von 22-Hydroxylisotryprostatin B, was darauf schließen ließ, dass EAW25734 Tryprostatin B aus der Fumitremorgin-Biosynthese abzweigt. In einer Kooperationsstudie mit Dr. Jinglin Wang haben wir eine spontane Umlagerung von 4-Dimethylallyl-1,3-Dihydroxynaphthalin zu zwei Tetrahydrobenzofuran- und einem Bicyclo[3.3.1]nonan-Derivat untersucht. Inkubation von FgaPT2, 1,3-Dihydroxynaphthalin und DMAPP unter 18O2-angereicherter Atmosphäre und mit 18O-angereichertem Wasser bestätigten, dass die beiden zusätzlichen Hydroxylgruppen von einem O2-Molekül stammten. Daher wurde ein Mechanismus vorgeschlagen, der mit einem reaktiven C4-Peroxyl-Zwischenprodukt beginnt, zu Radikalverschiebungen und zur Bildung trizyklischer Produkte führt. Diese Ergebnisse liefern ein weiteres Beispiel für die nichtenzymatische oxidative Zyklisierung und geben wertvolle Einblicke in die strukturelle Diversifizierung durch spontane Reaktionen. In Kooperation mit Jonas Nies wurde das fog-Gencluster in Aspergillus ruber entdeckt, das insgesamt neun Gene umfasst. Durch Genome-mining wurde darin auch das Prenyltransferasengen fogH identifiziert. Durch heterologe Expression in Aspergillus nidulans konnte gezeigt werden, dass das fog-cluster für die Biosynthese von dem prenylierten Salicylaldehyd Flavoglaucin und Analoga verantwortlich ist. Gendeletionsexperimente im heterologen Expressionsstamm deuteten darauf hin, dass die hoch-reduzierende Polyketidsynthase FogA zusammen mit drei zusätzlichen Enzymen für die Bildung der Benzylalkohol-Zwischenprodukte verantwortlich ist. Die Deletion von fogH führte zur Akkumulation von instabilen C5-hydroxylierten Hydrochinonen, die teilweise zu ihren Benzochinonformen oxidierten. Die biochemischen Untersuchungen zur Prenyltransferase FogH ergab, dass diese sowohl die Hydrochinon- als auch die Benzochinonform als Substrate akzeptieren kann. Anschließend wurden die Alkohole durch eine Oxidase, die nur prenylierte Intermediate als Substrate akzeptiert, zu den endgültigen Aldehydprodukten oxidiert. Des Weiteren konnte während der Isolierung in geringer Menge die spontane Oxidoreduktion von prenylierten Benzochinonalkoholen zu endgültigen Hydrochinonaldehyden beobachtet werden. Diese Studie zeigt die hocheffiziente und programmierte Maschinerie zur Biosynthese von Flavoglaucin und Analoga und hebt vor allem die Bedeutung der Prenyltransferase FogH im gesamten Kontext hervor. In dem Übersichtsartikel haben wir die strukturellen Besonderheiten, Verbreitung, biologische Aktivitäten und Biosynthese pilzlicher Benzaldehyde zusammengefasst. Der Schwerpunkt lag auf alkylierten Derivaten mit unterschiedlichen Alkylketten (C3, C5, C7, C9 oder C11) an der ortho-Position zur Aldehydgruppe und Meroterpenoiden mit Strukturelementen aus einem C5-, C10- oder C15-Prenylrest. Einfache Benzaldehyde, Benzophenonaldehyde und spirozyklische Benzaldehyde wurden ebenfalls behandelt. Die meisten der besprochenen Substanzen sind Salicylaldegydderivate, die von Polyketidsynthasen aus Schlauchpilzen synthetisiert werden. Diese werden entweder direkt als Aldehyde freigesetzt oder durch Modifikationsenzyme nachträglich oxidiert/reduziert