Characterisation of cytosolic prion protein-mediated putative cytotoxicity in neuronal cell lines

Prion diseases are a complex group of fatal neurodegenerative disorders with a broad host spectrum, which are characterised by strong neuronal cell loss, spongiform vacuolation and astrocytic proliferation. The molecular mechanisms of prion-mediated neurodegeneration are not yet fully understood. Recently, it has been proposed that neuronal cell death might be triggered by cytosolic accumulation of misfolded cellular prion protein (PrPC) due to impairment of proteasomal degradation. Cytosolic PrPC could result from either retro-translocation via the endoplasmatic reticulum-associated degradation system (ERAD) or abortive translocation of PrPC into the ER. Indeed, expression of cytosolic PrP (Cy-PrP) was shown to be neurotoxic both in vivo and in vitro. However, contradicting results on cytosolic PrP-mediated neurotoxicity in cultured cells have been reported. Cytosolic PrP–mediated cytotoxicity may play a central role in the pathogenesis of prion diseases. In order to investigate the molecular mechanisms of this process, a detailed analysis of N2a cells conditionally expressing cytosolic PrP (Cy-PrP) was performed in this study. The following results were obtained: First, Cy-PrP expression is not per se sufficient to trigger cytotoxicity in N2a cells independently of proteasome inhibition. Second, Cy-PrP is degraded with kinetics resembling the degradation of cell membrane-anchored full-length PM-PrP. In this process, the 20/26S proteasome was responsible for Cy-PrP degradation while the proteolysis of matured full length PM-PrP is not affected by the proteasomal system. Third, Cy-PrP accumulates in fine foci when expressed at high levels and co-localises with the cytosolic chaperone Hsc70 in EEA-1 positive endocytic vesicles. From these data it was proposed that the chaperone Hsc70 acts as a regulator for the controlled formation of amorphous Cy-PrP aggregates and their transport to endosomal vesicles. This Hsc70-dependent mechanism may confer protection to N2a cells against toxic accumulation of Cy-PrP in the cytosol.Prionenerkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen, neuropathologisch charakterisiert durch spongiforme Vakuolenbildungen im Hirngewebe, den Verlust neuronaler Zellen sowie die verstärkte Proliferation von Mikroglia und Astroglia. Die molekularen Mechanismen für eine derartige Prionen-vermittelte Neurodegeneration sind jedoch nicht vollständig aufgeklärt. In jüngster Vergangenheit wurden Beobachtungen gemacht, die annehmen lassen, dass eine zytosolische fehlgefaltete Form des zellulären Prionproteins (PrPC) der Auslöser für solch einen neuronalen Zelltod sein könnte. Dabei wird angenommen, dass eine Beeinträchtigung des proteasomalen Proteolysesystems eine Ursache für diese zytosolische Akkumulation von PrP darstellt. Die Akkumulation von zytosolischem PrP ist entweder die Folge eines Rücktransports von unreifem nicht-nativ gefaltetem PrP aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER), welches unter diesen Bedingungen nicht abgebaut wird (ER-assoziierter Abbau, ERAD) oder ist zurückzuführen auf einen unzureichenden post-translationalen ER-Import bei gesteigerter Genexpression. In der Tat wurde in vivo und in vitro ein zytotoxisches Potential für ein zytosolisch exprimiertes PrP (Cy-PrP) gezeigt. Mit Hilfe kultivierter Zelllinien wurden diesbezüglich jedoch widersprüchliche Ergebnisse publiziert, die nicht für eine generelle Toxizität des Cy-PrPs sprechen. Dennoch könnte eine Cy-PrP-vermittelte neuronale Toxizität eine zentrale Rolle bei der Pathogenese von Prionenerkrankungen spielen. Um diesem Mechanismus detaillierter auf den Grund zu gehen, wurden in dieser Studie neuronale N2a Zellen etabliert, die Cy-PrP sowohl transient induzierbar als auch stabil exprimieren. Mit Hilfe dieses Zellmodells konnten folgende Beobachtungen gemacht werden: Erstens, die transiente Expression von Cy-PrP über einen Zeitraum von 24 h und 48 h war nicht ausreichend, um im signifikanten Maßstab Zelltod in neuronalen Zellen zu induzieren. Dazu wurde zum einen die Vitalität der Zellen mittels MTT-Test gemessen. Zum anderen wurde die Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase (LDH) aus den Zellen bestimmt zur Abschätzung der Cy-PrP vermittelten Zytotoxizität. Um diese Daten zu untermauern wurde zusätzlich getestet, ob eine Cy-PrP Expression zu einer spezifischen Aktivierung der Caspase-3 führt, einem zentralen Parameter innerhalb der Apoptose-Signalwege. Auch hier konnte keine Cy-PrP spezifische Caspase-3-Aktivierung nachgewiesen werden. Um zelltyp-abhängige Effekte auszuschließen wurde das Cy-PrP in nicht-neuronalen Zellen exprimiert, zeigte jedoch auch hier keinen zytotoxischen Effekt in den MTT-Vitalitätstests. Auf Grund der postulierten biochemischen Ähnlichkeiten von Cy-PrP und PrPSc wurde das Cy-PrP im zweiten Teil der Arbeit bezüglich seiner Proteinase K-Resistenz, seiner Halbwertszeit und intrazellulären Proteolyse näher charakterisiert. Ersteres wurde ermittelt durch den Verdau der Zelllysate mit unterschiedlichen Protease K-Konzentrationen gefolgt von Immunoblotanalysen zur Detektion der resistenten Cy-PrP-Mengen. Im Gegensatz zum PrPSc, welches kontinuierlich von den als positive Kontrolle eingesetzten N2a58/22L-Zellen gebildet wird, wurde das Cy-PrP durch die Proteinase-K-Behandlung vollständig verdaut. Zur Bestimmung der Halbwertszeiten von Cy-PrP und dem vollständigen Prionprotein (PM-PrP) wurden Degradationsexperimente durchgeführt. Mit Hilfe der dazu durchgeführten Immunoblotanalysen konnte ein intrazellulärer Abbau des Cy-PrPs beobachtet werden. Dabei war die Abbaukinetik des Cy-PrPs vergleichbar mit der des PM-PrPs. Nähere Untersuchungen mit Hilfe des proteasomalen Inhibitors Epoxomicin zeigten, dass die Cy-PrP-Proteolyse Proteasom-vermittelt ist. Im Vergleich dazu erfolgte der Abbau des reifen, glycosylierten PM-PrPs unabhängig von der Inhibitorzugabe und war demzufolge nicht Proteasom-vermittelt. Drittens, obwohl die Cy-PrP-Proteolyse durch das Proteasom erfolgt, hatte die Überexpression von Cy-PrP keinen Einfluß auf die intrazelluläre Proteasomaktivität und das proteasomale Expressionslevel. Um zu untersuchen, ob eine Beeinträchtigung der Proteasomaktivität eine Cy-PrP-vermittelte Zytotoxizität auslösen kann, wurden MTT-Tests in Anwesenheit des spezifischen Proteasominhibitors Epoxomicin durchgeführt. Trotz Inhibition des Proteasoms konnte nach 24 stündiger Cy-PrP-Expression keine Cy-PrP-vermittelte Zytotoxizität detektiert werden. Viertens, intrazelluläre Lokalisationsstudien mit Hilfe von Fraktionierungs-experimenten und Immunofluoreszenzanalysen ergaben eine inhomogene intrazelluläre Verteilung des Cy-PrPs, charakterisiert durch starke Aggregat-ähnliche Detektionsmuster in den Immunofluoreszenzanalysen. Dieses Lokalisationsmuster wurde sowohl in den transient exprimierenden Zellen als auch in den stabilen N2a-Cy-PrP Zelllinien beobachtet. Kolokalisationsstudien mit verschiedenen Zellkompartment-spezifischen Markern ergaben keine ER- und Golgi-Lokalisation für das Cy-PrP. Dagegen wurde das PM-PrP wie erwartet Membran-ständig und im Golgi detektiert. Interessanterweise konnte hier gezeigt werden, dass die großen intrazellulären Cy-PrP-Akkumulationsherde mit endosomalen EEA-1 positiven Vesikeln und mit Hsc70, der konstitutiven Form des Hsp70, kolokalisierten. Dabei war zu beobachten, dass das zytosolische Hsc70 in den Mock-Kontrollen und PM-PrP-exprimierenden Zellen intrazellulär homogen verteilt war. Die Expression von Cy-PrP verursachte jedoch eine zelluläre Umverteilung von Hsc70, beobachtbar als Aggregat-ähnliches Detektionsmuster in den Immunofluoreszenzanalysen. Dabei hatte die Expression von Cy-PrP oder PM-PrP keinen Einfluß auf das Expressionslevel von Hsc70, analysiert in Immunoblotexperimenten. Fünftens, in dieser Arbeit gelang es zum ersten Mal stabile Cy-PrP-exprimierende Zelllinien zu etablieren. Dabei wurden zwei verschiedene Parentalzelllinien verwendet – die neuronalen N2a Zellen und die PrP0/0 neuronalen Vorläufer-Zellen. Diese Zelllinien zeigten keine Anzeichen von Apoptose wie verringerte Proliferation oder Chromatinkondensation. In den PrP0/0 neuronalen Vorläufer-Zellen kolokalisierte das Cy-PrP ebenfalls mit endosomalen EEA-1 positiven Vesikeln und mit Hsc70. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, dass allein das Auftreten von zytosolischem PrP nicht primär den neuronalen Zelltod initiieren muß. Zusätzlich könnte die effiziente Entfernung des Cy-PrPs aus dem Zytosol durch einen gezielten Transport in endosomale Vesikel eine erfolgreiche Methode sein, um eine toxische zytosolische PrP-Akkumulation zu unterbinden, was letztendlich von Zelltyp zu Zelltyp in seiner Leistungsfähigkeit variieren kann. Die beobachtete Kolokalisation von Cy-PrP und Hsc70 in solchen endosomalen Vesikeln könnte ein erster Hinweis darauf sein, dass Hsc70 eine wichtige Regulatorfunktion bei der kontrollierten Entstehung von amorphen Cy-PrP Aggregaten und deren Transport in endosomale Vesikel übernimmt. Diese Hsc70-abhängige Translokation von Cy-PrP könnte einen wesentlichen Schutzmechanismus gegen eine toxische Akkumulation von Cy-PrP in N2a-Zellen widerspiegeln