The mechanism of ILEI cleavage and its physiological relevances

Metastasierung ist ein sehr häufiger Prozess bei Krebserkrankungen und das entscheidende Kriterium für durch Krebs verursachte Todesfälle. Metastasierende Tumorzellen wandern aktiv im Gewebe, gehen ins Blut/Lymphe und werden invasiv, d.h. wandern in entfernte Organe aus, wo sie Tochtergeschwülste (Metastasen) bilden. Dies wird durch genomische Veränderungen, die Tumormikroumgebung mit erhöhter Protease-Aktivität und modifiziertem ECM und Stroma unterstützt. Infolgedessen brechen die Zellen durch Gewebebarrieren und Basalmembranen und es werden sekundäre Tumore in entfernten Organen gebildet. Bei den ersten Schritten der frühen Metastasierung, bevor sich die Zellen aus dem primären Tumor lösen und sich verbreiten, tritt ein Prozess namens Epitheliale mesenchymale Transition (EMT) auf, bei dem die Zellen ihre epitheliale Polarität und Fähigkeit zur Zellkontaktbildung verlieren. Sie weisen dann den Phänotyp von Bindegewebszellen (Fibroblasten) auf. EMT erfordert eine kooperative Wirkung von aktiviertem Ras und TGFß Signalling. Eine Studie über Expressionsanalyse, um EMT spezifische , durch TGFß induzierte Targetgene in einem epithelialen Maus- Brustkrebs- Zellmodell zu finden , hat ein neues, Zytokin ähnliches Protein namens ILEI (Interleukin like EMT-Inducer) identfiziert. TGFß reguliert ILEI auf der translationalen Ebene hoch. Dauerhafte Überexpression von ILEI in einigen Zelllinien verursacht EMT und verstärkt Tumorwachstum und Metastasierung. ILEI ist ein fakultativ sezerniertes Protein und seine sekretierte Form wird durch Serinproteasen wie Plasmin spezifisch an einer R / S Site am N-Terminus gespalten. Die physiologische Rolle der ILEI Spaltung in der Tumorgenese wurde bei tumorigenischen aber nicht metastatischen EpC40 Zellen, die verschiedene mutierte Formen des Proteins überexprimieren, analysiert. Das Protein wurde mutiert; entweder durch Einführung von Punktmutationen auf der Spaltstelle (cleavage mutant), welche das proteolytische Spalten durch Proteasen inhibieren, oder das Propeptid an dem N-Terminus wurde deletiert (Δ-pro peptid mutant), was zu einem konstitutiv gespaltenen, reifen ILEI Protein führt. (bei dem Protease-Spaltung nicht mehr benötigt wird.) Das Fehlen des Propeptides am N-Terminus gewährleistet.eine hohe Sekretion des Proteins. In vivo Tumorigenese Experimente haben demonstriert, dass die cleavage Mutante überexprimierte EpC40 Zelle kleine Tumoren und sehr wenige Metastasen im Vergleich zu den wt-ILEI überexprimierten Zellen gebildet haben. Daneben beschleunigten die Δ-pro Peptid ILEI überexprimierten Zellen die Tumorentwicklung sogar stärker als die wt-ILEI überexprimierten Zellen und wiesen erhöhte Metastasierung auf. Wir untersuchten die Notwendigkeit der ILEI Spaltung für ein verstärktes Tumorwachstum im Tumorigenese-Testen bei denen ein nicht spezifischer Proteaseninhibitor, Aprotinin verwendet wurde. 10 Wir erhielten eine signifikant verminderte Tumorwachstumsrate und Tumorgröße nur bei wt-ILEI überexprimierten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Tiere. Wie erwartet, hatte Aprotinin bei durch die Δ-pro peptid Mutante erzeugten, schnellwachsenden Tumoren keine Wirkung, da dieses Proteiun ja bereits gepalten ist. In vitro Experimente wießen darauf dass, die ILEI Sekretion durch exogenes Plasmin stimuliert werden kann. In weiteren Analysen zur Erklärung der Ursache dieses Phänomenes, wurde getestet, ob die ILEI-Sekretion durch die Aktivierung von Plasmin – uPAR Signalling reguliert werden könnte und nicht durch einen „autocrine Feed-back“ Mechanismus von ILEI, bei dem die gespaltene reife ILEI-Form seine eigene Sekretion ausgelöst haben könnte. Im zweiten Teil dieser Diplomarbeit wurde ein doxycyclin induzierbarer (TET-ON) ILEI transgenischer Mausstamm in vitro und in vivo auf die Induzierbarkeit und die Expressions-Stärke des durch das ILEI Transgen kodierte Protein bestimmt. Zwei Transgene, TetrTA und tetO-ILEI, wurden durch homologe Rekombination in spezifische Loci (ROSA26 and Col1A1) des Mausgenoms eingeführt, um Nebenwirkungen von zufälliger Integrationen, wie Zerstörung von endogenen Genen, zu vermeiden. Doxycyclin induzierte ILEI Expression wurde in allen untersuchten Geweben außer in der Lunge detektiert. Die höchsten Expression Levels wurden im Dünndarm und Dickdarm gefunden. Dieses induzierbare ILEI transgenische System ermöglicht das Studieren der physiologischen Funktion von ILEI und seiner Rolle in der Krebsentwicklung.Metastasis is the main reason for cancer related deaths. Epithelial tumor cells become invasive and motile, aided by genomic alterations and the tumor microenvironment with increased protease activity and modified ECM and stroma. As a result, the cells break down tissue barriers and establish secondary tumors at distant organs. During the early steps of metastasis, when tumor cells start to disseminate from the primary cancer, a process called epithelial to mesenchymal transition (EMT) occurs, in which cells loosen cell-cell contacts and deregulate their epithelial polarity. EMT requires a cooperative action of activated Ras and TGFb signaling. Expression profiling studies to identify TGFb-induced, EMT specific target genes in a murine mammary epithelial cell model has revealed a novel cytokine like protein, named ILEI (interleukin like EMT inducer). TGFb upregulates ILEI at the translational level. Stable overexpression of ILEI in several cell lines caused EMT, elevated tumor growth and aspects of metastasis. ILEI is a secreted protein and its secreted form is cleaved by serine-type proteases, like plasmin, specifically at an R/S site at its N terminus. The physiological role of ILEI processing in tumorigenesis was analyzed using tumorigenic but non-metastatic EpC40 cells overexpressing (OE) different mutant forms of the protein. The protein was mutated either by introducing point mutations at the cleavage site, which inhibited proteolytic cleavage by proteases, or the pro-peptide at the N-terminus was deleted, creating an artificially matured protein not requiring proteolytic cleavage. This lack of the pro-peptide at the N-terminus caused constitutive, abnormally high secretion of the protein. In vivo tumorigenesis experiments demonstrated that cleavage mutant overexpressing EpC40 cells formed small tumors and very few metastases compared to the wt-ILEI OE cells. In addition, Δ-pro peptide ILEI OE cells accelerated tumor development even more than the wt-ILEI OE cells and exhibited enhanced metastasis. We examined the necessity of ILEI cleavage for generating elevated tumor growth in tumorigenesis assay using a non-specific serine protease inhibitor, aprotinin. Mice treated with this inhibitor showed significantly decreased tumor growth rates and tumor sizes induced by wt-ILEI OE cells, as compared to animals not treated with inhibitor. In vitro assays indicated that ILEI secretion can be stimulated by exogenous plasmin. Further analyses in attempts to explain the cause of this phenomenon suggested that it might occur via the activation of plasmin - uPAR signaling, and not through an autocrine feedback mechanism of ILEI, where the processed form would trigger its own secretion. In the second part of this diploma thesis, a doxycyclin inducible (TET-ON) ILEI transgenic mouse strain was characterized in vitro and in vivo for the inducibility and expression levels of the ILEI transgene. The two transgenes, TetrTA and tetO-ILEI were introduced into specific loci (ROSA26 and Col1A1) by homologous recombination, eliminating the side effects of random integration such as disruption of endogenous genes. Doxycyclin responsive ILEI expression was detected in all examined tissues except lung. Highest expression levels were found in small and large intestines. This inducible ILEI transgenic system allows studying the physiological role of ILEI and its role in cancer development