Structural and Biochemical Characterization of the Human Serine Protease HtrA1

HtrA1 gehört zur Familie der HtrA (High temperature requirement) Serin-Proteasen, einer Gruppe hochkonservierter Proteasen, die sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Mitglieder umfasst. Gemeinsames Merkmal dieser Serin-Proteasen ist das Vorhandensein einer hoch-konservierten Trypsin-ähnlichen Domäne und mindestens einer C-Terminalen PDZ-Domäne. HtrA1 wurde ursprünglich als weniger exprimiertes Gen in SV40-transfomierten Fibroblasten identifiziert und wird außerdem mit verschiedenen Krankheitsbildern, wie Arthritis, altersbedingter Makuladegeneration oder der Alzheimerschen Krankheit in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit werden drei Kristallstrukturen von HtrA1 präsentiert. Sie zeigen die Protease Domäne in der inaktiven und aktiven Konformation. Beide Konformation weisen vergleichbare strukturelle Gegebenheiten im Vergleich mit anderen HtrA Familienmitgliedern auf. Zugleich werden aber signifikante Besonderheiten für HtrA1 deutlich. Interessanterweise ist die Bindung des Peptid-Inhibitors in das aktive Zentrum der Protease Domäne ausreichend, um konformationelle Änderungen hervorzurufen, die durch Reorientierung der Schleifen, die das aktive Zentrum gestalten, von einer inaktiven zu einer aktiven Konformation führen. Schleife L3, die in der inaktiven Konformation ungeordnet ist, zeigt jetzt eine geordnete Konformation und definierte Interaktionen mit dem Inhibitormolekül. Diese Erkenntnis ist unterschiedlich zu vergleichbaren bekannten HtrA Strukturen in denen L3 eine geordnete Konformation durch spezifische Interaktionen mit der PDZ Domäne einnimmt. Im zweiten Teil der Arbeit stand die Entwicklung eines Aktivitäts-Assays und die Messung der enzymatichen Aktivität verschiedener verkürzter Versionen von HtrA1 im Vordergrund. Es wurden Inhibitoren und Peptide auf die Fähigkeit hin getestet, an HtrA1 zu binden und die enzymatische Aktivität zu regulieren. Dabei sollte vor allem die Rolle der PDZ Domäne untersucht werden. Die PDZ Domänen der bakteriellen HtrAs sind wichtig für die Erfassung von Protein Faltungsstress, sie sind Bindungsstellen für Substrate und regulieren die enzymatische Aktivität. Für das humane HtrA1 konnte gezeigt werden, dass die PDZ Domäne entbehrlich für die katalytische Aktivität ist, aber eine Rolle für die allosterische Regulation von HtrA1 spielt. Außerdem beeinflusst die PDZ Domäne die Produktlänge von geschnittenen Substraten. Vor allem interessant ist, daß die Daten auch auf die Möglichkeit hindeuten, daß die Protease durch einen konservierten Mechanismus der Oligomerisierung reguliert wird. Dieser Mechanismus der Regulation durch Oligomerisierung wurde zuerst für das bakterielle Familienmitglied DegP beschrieben (Krojer et al. 2008), konnte aber nicht für bakterielles DegS oder humanes HtrA2 gezeigt werden. Es ist daher spannend zu spekulieren, dass HtrA1 analog zu DegP ein Molekül darstellt, das in der Lage ist ungefaltete oder fehlgefaltete Proteine zu sequestrieren, um sie der Rückfaltung oder dem Abbau zuzuführen. Damit könnte es ein Teil der Stressantwort auf ungefaltete Proteine in der ECM sein, ein Qualitäts-Kontrollsystem das noch nicht sehr charakterisiert ist. Obwohl die hier präsentierten Kristallstrukturen von HtrA1 und die biochemischen Analysen unser Wissen über HtrA1 erweitern, ist die Zahl der offenen Fragen immer noch immens. Die dargestellten Ergebnisse können somit die Grundlage für wichtige Experimente in der Zukunft bilden, die einen weiterführenden Einblick in den Mechanismus der Aktivierung der humanen Serin-Protease HtrA1 ermöglichen.The HtrA (high temperature requirement) family represents a new class of oligomeric serine proteases in which a catalytic domain is combined with one or more C-terminal PDZ (protein-protein interaction) domains. These proteins are widely conserved and found in most organisms from bacteria to mammals. In this thesis, studies were performed to obtain an understanding of the structural properties of human HtrA1 and the regulation of its proteolytic activity. Crystallization and subsequent structure solution consisted of several consecutive steps, beginning with the establishment of an efficient and reproducible protein purification procedure, followed by N-terminal sequencing, mass spectrometry, size-exclusion chromatography and dynamic light scattering in order to detect any unwanted post-translational modifications, to elucidate the molecular weight of the oligomer in solution and the homogeneity of the sample. The crystallization of the protein was performed by employing the widely used sparse-matrix screening methods. After production of diffraction quality crystals, the crystal structure of HtrA1 was solved by molecular replacement (MR). To access the structural properties of HtrA1 different deletion constructs of the proteolytic active and inactive form of HtrA1 were applied for crystallization. Finally three crystal structures are presented for human HtrA1. One crystal structure shows the protease domain in the inactive conformation and two showing the protease plus PDZ-domain in the inactive and active conformation. To get the active conformation, HtrA1 was co-crystallized with a peptide inhibitor which was shown to abolish the proteolytic activity. With the crystal structures it was possible to elucidate the organization of the oligomer and the structural determinants of the active site. The active and inactive states both share common structural features with other members of the HtrA family. But they also show striking mechanistic differences. Interestingly, binding of the peptide inhibitor to the active site of the protease domain alone leads to conformational changes of all active site loops setting up the active conformation showing defined interactions with the peptide inhibitor. This observation is different to known HtrA structures where the active site becomes ordered by specific interactions with the PDZ domain or to a stress peptide bound to the PDZ domain. In the second part of the study, the development of an activity assay and the measurement of enzymatic activity of different deletion constructs was the main focus. Furthermore inhibitors, peptides and substrates were tested for the ability to bind to HtrA1 and to regulate the enzymatic activity. The role of the PDZ domains in human HtrA1 was one of the leading questions. While in bacterial HtrAs the PDZ domains function as sensors of protein folding stress, binding sites for substrates, regulators of the enzymatic activity and are required for oligomerization, it could be shown that in human HtrA1 they are dispensable for proteolytic activity but are involved in allosteric regulation. Furthermore they influence the product size of cleaved substrates. Most interestingly these data also suggest that human HtrA1 could be regulated by a conserved mechanism of activation by oligomerization which was first described for bacterial DegP (Krojer et al. 2008). It could not be shown for DegS or human HtrA2. It is therefore exciting to speculate that in analog to DegP HtrA1 establishes a packaging device that is able to sequester unfolded proteins for partitioning between refolding and degradation pathways. Although the crystal structures of HtrA1 and biochemical analysis have enlarged our knowledge about HtrA1, there are still a great number of open questions regarding the regulation of this family member. Therefore the presented results could be the guide for future experiments that will allow a detailed view into the activation mechanism of human HtrA1