Alfa-amylase of Aspergillus oryzae : a study on its production by solid state fermentation, characterization, purification and stabilization

Las condiciones de fermentación para obtener una máxima producción de α-amilasa utilizando salvado de trigo como sustrato de la FES resultaron: humedad inicial 58% (bh), temperatura 35°C, pH inicial 6,2-6,5. En estas condiciones el máximo de producción de enzima es alcanzado entre las 36 y 48 hs de fermentación. Se estudió la influencia del pH inicial en la sintesis de la α-amilasa relacionándose la falta de producción de la misma a pHs inferiores a 5,5 con un posible mecanismo de regulación de la sintesis de la enzima por el pH del medio de cultivo. Se desarrolló un modelo matemático que describe la pérdida de peso seco del sistema y el consumo de sustrato a lo largo de la fermentación. Este modelo vincula dichas variables con el desarrollo de la biomasa, por lo tanto tiene la potencialidad de ser un método sencillo para la estimación del crecimiento del micelio en FES. En las condiciones arriba mencionadas la cantidad de proteína correspondiente a la α-amilasa es de un 25-30 % de las proteínas totales presentes en el extracto de fermentación y la presencia de actividades enzimáticas contaminantes resultó minima. La α-amilasa fue purificada a partir de los extractos de fermentación empleando DEAE - Sepharose y Concanavalina A - Sepharose. El método de purificación desarrollado permite purificar a la α-amilasa 3-4 veces así como la remoción de otras actividades enzimáticas y pigmentos producidos durante la fermentación. Se estudió la inactivación térmica de la α-amilasa de Aspergillus oryzae deshidratada. La vida media de la enzima fue incrementada mediante su liofilización, pero este incremento resultó mayor cuando la enzima fue deshidratada en presencia de carbohidratos o polivinilpirrolidonade tal forma que ésta quede incluida dentro de una matriz sólida. Los efectos de protectores de las matrices no pudieron ser explicados solo en base al estado vitreo de los sistemas, dado que la inactivación térmica de la enzima así como el pardeamiento no enzimático ocurrieron en todas las matrices vitreas estudiadas y a una velocidad particular para cada sistema. Para una matriz dada la protección resultó máxima en el estado vitreo, mientras que las condiciones que favorecieron la cristalización de las mismas produjeron una rápida inactivación de la enzima y un incremento del pardeamiento no enzimático. La matriz de trehalosa demostró caracteristicas superiores brindando una mayor protección contra la inactivación térmica e inhibiendo más efectivamente el pardeamiento no enzimática, aún en condiciones en que la matriz se encontró en estado gomoso (hasta 100°C). Los resultados concernientes al distinto grado de protección dado por este azúcar a las diferentes enzimas presentes en el extracto sugieren la existencia de una interacción enzima-matriz necesaria para la estabilización y para la cual la naturaleza de la molécula proteica es de relevancia.Maximal α-amylase production on wheat brand as substrate of the SSF was achieved by cultivating Aspergillus oryzae NRRL 3485 at initial moisture content of 58%, a temperature of 35°C and an initial pH range of 6,2-6,5. At these experimental conditions, the maximal production of the enzyme was reached between 36-48h of fermentation. The enzyme in the crude extract was around 25-30% of total proteins, being the amount of other contaminating enzymes produced by the fungus not significantly important. The effect of the initial pH of the SSF on the enzyme production was studied. Regarding the drop on the α-amylase yield when the initial pH of the substrate was lower than 5,5, a possible regulation mechanism related to the pH of the substrate was suggested for the synthesis of enzyme in SSF conditions. A mathematical model that describes the loss of dried weight and substrate consumption at the optimal conditions of the SSF was developed. As this mathematical model makes a connection between those fermentation variables and the biomass generation, it could be considered a potentially tool for mycelia growth indirect measurement in SSF. The α-amylase was purified from the fermentation extracts by chromatography on DEAE-Sepharose and Concanavaline A-Sepharose. This proposed method allowed us to obtain a 3-4 times purified α-amylase preparation, free of co-produced pigments and contaminating enzymes. Thermal inactivation of the dehydrated α-amylase was studied. Removal of water increased thermal stability of the enzyme. Furthermore, a greater enhanced of the thermal stability was reached when the enzyme was dehydrated in the presence of carbohydrates or polyvnylpyrrolidone, wich constitute a matrix that included the enzyme. Since inactivation of α-amylase and non enzymatic browning took place even in the glassy matrices, the protective effect could not be explained only based on the glassy conditions of the systems. For any particular matrix the protective effect was maximal when it was glassy, while conditions which favored matrix crystallization lead to rapid inactivation of the enzyme. Trehalose matrix was superior in order to stabilize Aspergillus oryze α-amylase and to prevent the non-enzymatic browning of the fermentation extract. These advantages of trehalose could be achieved even if the sugar matrix was in rubbery state (100°C). The effect of trehalose matrix on the thermal stability was different for each one of the enzymes present in the fermention extract. This fact suggests that specific trehalose-protein interactions, due to the nature of the protein molecule are of relevance for the stabilization of the enzyme.Fil:Terebiznik, Mauricio R.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina