Alfa-amilasa de Aspergillus oryzae : estudios de producción por fermentación en sustrato sólido, purificación y estabilización

Las condiciones de fermentación para obtener una máxima producción de α-amilasa utilizando salvado de trigo como sustrato de la FES resultaron: humedad inicial 58% (bh), temperatura 35°C, pH inicial 6,2-6,5. En estas condiciones el máximo de producción de enzima es alcanzado entre las 36 y 48 hs de fermentación. Se estudió la influencia del pH inicial en la sintesis de la α-amilasa relacionándose la falta de producción de la misma a pHs inferiores a 5,5 con un posible mecanismo de regulación de la sintesis de la enzima por el pH del medio de cultivo. Se desarrolló un modelo matemático que describe la pérdida de peso seco del sistema y el consumo de sustrato a lo largo de la fermentación. Este modelo vincula dichas variables con el desarrollo de la biomasa, por lo tanto tiene la potencialidad de ser un método sencillo para la estimación del crecimiento del micelio en FES. En las condiciones arriba mencionadas la cantidad de proteína correspondiente a la α-amilasa es de un 25-30 % de las proteínas totales presentes en el extracto de fermentación y la presencia de actividades enzimáticas contaminantes resultó minima. La α-amilasa fue purificada a partir de los extractos de fermentación empleando DEAE - Sepharose y Concanavalina A - Sepharose. El método de purificación desarrollado permite purificar a la α-amilasa 3-4 veces así como la remoción de otras actividades enzimáticas y pigmentos producidos durante la fermentación. Se estudió la inactivación térmica de la α-amilasa de Aspergillus oryzae deshidratada. La vida media de la enzima fue incrementada mediante su liofilización, pero este incremento resultó mayor cuando la enzima fue deshidratada en presencia de carbohidratos o polivinilpirrolidonade tal forma que ésta quede incluida dentro de una matriz sólida. Los efectos de protectores de las matrices no pudieron ser explicados solo en base al estado vitreo de los sistemas, dado que la inactivación térmica de la enzima así como el pardeamiento no enzimático ocurrieron en todas las matrices vitreas estudiadas y a una velocidad particular para cada sistema. Para una matriz dada la protección resultó máxima en el estado vitreo, mientras que las condiciones que favorecieron la cristalización de las mismas produjeron una rápida inactivación de la enzima y un incremento del pardeamiento no enzimático. La matriz de trehalosa demostró caracteristicas superiores brindando una mayor protección contra la inactivación térmica e inhibiendo más efectivamente el pardeamiento no enzimática, aún en condiciones en que la matriz se encontró en estado gomoso (hasta 100°C). Los resultados concernientes al distinto grado de protección dado por este azúcar a las diferentes enzimas presentes en el extracto sugieren la existencia de una interacción enzima-matriz necesaria para la estabilización y para la cual la naturaleza de la molécula proteica es de relevancia