Characterization of mature T-cell leukemias by next-generation sequencing and drug sensitivity testing

Mature T-cell malignancies comprise a heterogeneous group of diseases with widely variable clinical courses, ranging from indolent, slowly progressing to rapidly progressing disease, leading to death. While some compounds have been found to be active in these diseases, much work remains to be done to characterize the disease entities genetically and molecularly and develop effective therapeutic options. Recent studies have found recurrent genetic mutations in the JAK/STAT pathway that contribute to the pathogenesis of T-LGL leukemia and PLL leukemia. The aim of this PhD project was to reveal new somatic mutations underlying different mature T-cell malignancies and further elucidate their functional impact on the pathogenesis of the disease. Furthermore, ex vivo drug screening of selected patient samples was applied in an effort to find clinically relevant drugs for the individual patient. In the first study, exome sequencing was applied to three STAT-mutation negative T-LGL leukemia patients to elucidate the molecular background of this subset of patients. Mutations in genes associated with either the STAT-pathway directly (such as PTPRT) or T-cell activation were observed in all patients. These novel mutations are potentially biologically relevant and are associated with a similar disease phenotype as that of patients with mutations in the STAT3 gene. In the second study, the exome sequencing of additional LGL leukemia patients revealed recurrent STAT3 mutations outside the hotspot SH2-domain. Further targeted amplicon sequencing of the entire STAT3 gene in a larger T-LGL cohort revealed mutations in the coiled-coil and DNA-binding domain present in 4% of patients. Similarly, in the third study, STAT5B mutations previously found to be rare in CD8+ LGL leukemia (2%) were discovered to be significantly over-represented in CD4+ cases (55%). For both studies, the activation and phosphorylation patterns of the new mutations were confirmed with functional assays. In the fourth study, T-PLL leukemia patient samples were screened with a drug sensitivity and resistance testing platform to elucidate drug sensitivity patterns. The patients were divided by selective sensitivities to HDAC, PI3K/AKT/mTOR, HSP90, and JAK inhibitors. Intriguingly, all T-PLL samples were sensitive to the CDK inhibitor SNS-032, which was shown to inhibit distal TCR signaling and points to a centrally disturbed cell cycle regulation. Furthermore, different classes of p53 activators showed T-PLL specific responses, indicating a previously unexplored targeted treatment for these patients. In combination with the drug responses, a targeted sequencing of known JAK/STAT mutations was applied together with gene expression profiling to molecularly characterize this rare disease. Strikingly, drug responses did not link to the presence of JAK/STAT mutations, TCL1A-activating translocations, or ATM deletion status, suggesting that screening for recurrent genetic biomarkers does not readily translate into applicable deductions on effective therapeutic strategies in T-PLL. However, the ex vivo drug response data enabled the discovery of new drug classes with potential efficacy in T-PLL.Mogna T-cells leukemier representerar en heterogen grupp av sjukdomar som har väldigt varierande kliniska uttryck, från kroniska, långsamt framskridande till snabbt framskridande sjukdomar med dödligt resultat. Vissa läkemedel är effektiva i behandlingen av dessa sjukdomar men mycket finns ännu att utforskas beaktande sjukdomarnas genetiska och molekylära bakgrund samt utvecklingen av effektivare behandlingsalternativ. Färska undersökningar har påvisat återkommande genetiska mutationer i JAK/STAT signaltransduktionsvägen som bidragande faktorer till T-LGL och T-PLL leukemiernas patogenes. Syftet med denna doktorsavhandling var att avslöja nya somatiska mutationer som orsakar dessa mogna T-cells leukemier och ytterligare klarlägga deras funktionella inverkan på sjukdomens patogenes. Dessutom utfördes ex vivo läkemedelstestning på utvalda patientprover i ett försök att hitta kliniskt relevanta läkemedel för individuella patienter. I det första delprojektet utnyttjades exomsekvensering av tre STAT-mutation negativa T-LGL leukemi patienter för att klarlägga den molekylära bakgrunden hos denna undergrupp av patienter. Mutationer i gener associerade direkt med STAT-signaleringsvägen eller T-cellernas aktivering observerades i alla patienter. Dessa tidigare okända mutationer är potentiellt biologiskt relevanta och associerade med liknande sjukdomsbild som patienter med STAT3 mutationer. I det andra projektet avslöjade exomsekvensering av ytterligare T-LGL leukemi patienter återkommande STAT3 mutationer utanför hotspot-området i SH2 domänet. Vidare inriktad amplikon sekvensering av hela STAT3 genen i en större grupp av T-LGL patienter avslöjade mutationer i olika domäner i 4% av patienterna. I den tredje undersökningen, hittades på liknande sätt STAT5B mutationer som förut funnits vara sällsynta i CD8+ LGL leukemi (2%) att vara överrepresenterade i CD4+ sjukdomsfall (55%). STAT5B mutationer kan därmed effektivt användas som ett diagnoskriterium för CD4+ fall av T-LGL leukemi. I båda projekten användes funktionella experiment för att bekräfta de nya mutationernas aktiverande och fosforylerande effekt. I det fjärde projektet testades T-PLL leukemi patientprover mot 300 läkemedel på en sensitivitet och resistans plattform för att klargöra T-PLL cellernas läkemedelskänslighet. Patienterna skildes åt av olika känsligheter för HDAC, PI3K/AKT/mTOR, HSP90 och JAK inhibitorer. Intressant nog var alla T-PLL prover känsliga för CDK-inhibitorn SNS-032, som bevisades kunna inhibera signalering via T-cell receptorn vilket antyder om en centralt rubbad reglering av cellcykeln i denna sjukdom. Också olika klasser av p53-aktiverande läkemedel visade T-PLL specifik effektivitet, vilket indikerar en tidigare outforskad riktad terapiform för denna patientgrupp. I kombination med läkemedelstestningen utfördes riktad sekvensering av kända JAK/STAT mutationer samt profilering av genuttryck för att karaktärisera denna sällsynta sjukdom molekylärt. Överraskande nog kunde läkemedelskänsligheter inte anknytas till närvaron av JAK/STAT mutationer, TCL1A-aktiverande translokationer eller ATM deletioner vilket antyder att undersökning av återkommande genetiska biomarkörer inte direkt kan översättas till lämpliga slutsatser om effektiva terapistrategier i T-PLL. Däremot kan ex vivo information om läkemedelskänslighet möjliggöra upptäckter av nya läkemedelsklasser med potentiell effekt för T-PLL patienter