Characterization of cell populations in ascites of ovarian cancer patients

Das epitheliale Ovarialkarzinom ist für die höchste Mortalitätsrate innerhalb von gynä-kologischen Krebserkrankungen in der westlichen Welt verantwortlich. Der Hauptgrund dafür ist, dass Eierstockkrebs, aufgrund fehlender Symptomatik in frühen Stadien, oft erst spät erkannt wird und daher meist mit einem ausgeprägten Tumorbefall des Peri-toneums bei der Erstdiagnose einhergeht. Ein vielversprechender Ansatz, um Patientin-nen optimal behandeln zu können, beziehungsweise neue Therapieansätze zu schaffen, ist die Unterteilung der serös-papillären Ovarialkarzinome in unterschiedliche Subklas-sen. Diese Einteilung kann im Hinblick auf die Reaktion auf Chemotherapie, aber auch aufgrund anderer Faktoren, wie zum Beispiel der zugrundeliegenden Genmutation, ge-schehen. Die Grundidee für diese Studie war die möglichst umfassende Charakterisie-rung von Patientenbiomaterial inklusive der Analyse von Expression und Häufigkeit verschiedener, bekannter (Tumor-) Zellmarker. Insbesondere der zelluläre Anteil der malignen Bauchraumflüssigkeit (Aszites), der sowohl von freischwimmenden Einzel-zellen als auch aus aggregierten Tumorzellhaufen, sogenannten Sphäroiden, gebildet wird, wurde genau untersucht. Dazu wurde ein Sechs-Farben-Durchflusszytometrie-Panel entwickelt, mit dem die gleichzeitige Bestimmung der Oberflächenmarker CD45, EpCAM, CD44, CD133 und L1CAM in einer Probe möglich ist. Resultierende Häufig-keiten bestimmter Zellen in den beiden Aszitesfraktionen, sowie im Tumorgewebe, wurden in Folge mit unterschiedlichen Ausbreitungsmustern des Tumors in der Peri-tonealhöhle, entweder als miliare, über den Bauchraum verteilten, oder wenigen, dafür ausgeprägten Tumorabsiedelungen, korreliert. Unter anderem konnte so ein Zusammen-hang zwischen einer Population CD44 positiver Zellen und wenigen, ausgeprägten Ab-siedelungen, gezeigt werden. Eine zusätzliche Analyse des Transkriptoms mit RNA-Seq und verschiedenen biostatistischen Methoden offenbarte 460 differentiell exprimierte Gene zwischen den beiden Ausbreitungsmustern des Tumors, davon 180 hoch- und 280 runterreguliert im miliaren Subtyp. Viele dieser Gene konnten Genclustern zugeordnet werden, die mit der Interaktion mit extrazellulären Matrixproteinen oder Zelladhäsion assoziiert werden. Außerdem konnte eine zuvor publizierte, molekulare Subklassifizie-rung basierend auf 112 Genen, in dieser Studie anhand von Genexpressionsprofilen von 8 Patientinnen, nachgewiesen werden. Die neue Subklassifizierung, basierend auf dem intraperitonealen Ausbreitungsmuster des Tumors, überlappt aber nicht mit der vorheri-gen. Sowohl durchflusszytometrische als auch Transkriptomdaten zeigen molekulare Unterschiede zwischen den neu definierten Subklassen serös-papillärer Ovarialkarzi-nome. Was dies für das Gesamtüberleben oder dem progressionsfreien Überleben von Patientinnen mit Eierstockkrebs bedeutet, wird sich in den kommenden Jahren zeigen.Epithelial ovarian cancer is the leading cause of death from gynecological malignancies in the western world. Reasons for the low 5-year survival rate include diagnosis at ad-vanced stages due to missing or unclear symptoms, massive intraperitoneal tumor load, and chemotherapy resistance after relapse, although initial response to platinum-based therapy is about 80%. Therefore it is of importance to subdivide patients suffering from EOC into subclasses, according to chemotherapy-response, but also other factors in-cluding gene mutations to provide the appropriate treatment. The aim of this project was a comprehensive characterization of patients´ biomaterials including analysis of expres-sion and frequency of known (tumor) cell markers, to find connections between cell populations and modes of peritoneal tumor spread or other subclasses. Of special inter-est was the characterization of cell populations in malignant ascites, build up from single cells and cellular aggregates, so called spheroids. To accomplish this, a six-color flow cytometry panel was set up and successfully tested, allowing for simultaneous analysis of the surface markers CD45, EpCAM, CD44, CD133, and L1CAM in each sample. Resulting frequencies of cell population in ascites and tumor tissues were correlated with different peritoneal implantation patterns, including i) miliary and planar tumor spread and ii)no or few, but bigger exophytic and nodular growing implants. The population of cells expressing CD44 was shown to be associated with the subtype of no/few big tumor implants. Furthermore, transcriptome analysis using RNA sequencing and biostatistical methods revealed 460 genes differentially expressed between the dif-ferent modes of tumor spread, consisting of 180 up- and 280 down-regulated genes in patients with miliary tumor spread. Many of these genes could be annotated to pathways associated with cell adhesion and interaction with extracellular matrix. Moreover, a previously defined molecular subclassification using 112 genes in patients with different overall and progression free survival could be validated in this study, based on expression profiles of eight patients. The new subclassification of patients according to the mode of peritoneal tumor spread does not overlap the more recent molecular subclassification. Both, FC and whole transcriptome data demonstrate the molecular differences of the newly defined subclasses of serous EOC and implications for patients´ outcome will be seen in the future