Nueva función de la ruta de la proteína quinasa C en el mantenimiento de la integridad genómica

The main function of the Protein Kinase C (PKC) pathway in Saccharomyces cerevisiae is the maintenance of the cell wall integrity. In this work we have described that members of the PKC pathway like the MAP kinase Slt2 and the kinase Pkc1 have important roles in the cellular response to DNA damage, and we have extended the studies to the mammal PKCs. Regarding to the role of Slt2 in the DNA metabolism our results showed that the slt2 mutant strain was hypersensitive to a variety of genotoxic treatments, including incubation with hydroxyurea (HU), methylmetanosulfonate (MMS), phleomycin or UV irradiation. Furthermore, Slt2 was activated by all these treatments, which suggests that Slt2 plays a central role in the cellular response to genotoxic stresses. Activation of Slt2 was not dependent on the DNA integrity checkpoint. For MMS and UV, Slt2 activation required progression through the cell cycle. In contrast, HU also activated Slt2 in nocodazol-arrested cells, which suggests that Slt2 may respond to dNTP pools alterations. However, neither the protein level of the distinct ribonucleotide reductase subunits nor the dNTP pools were affected in a slt2 mutant strain. An analysis of the checkpoint function revealed that Slt2 was not required for either cell cycle arrest or the activation of the Rad53 checkpoint kinase in response to DNA damage. However, slt2 mutant cells showed an elongated bud and partially impaired Swe1 degradation after replicative stress, indicating that Slt2 could contribute, in parallel with Rad53, to bud morphogenesis control after genotoxic stresses. In relation to Pkc1 and its connection with the DNA damage response, our results showed that similarly to slt2, pkc1 mutants are hypersensitive to HU, MMS, Phleo and UV radiation. Moreover, the protein Pkc1 undergoes a delay in its electrophoretic mobility after inducing DNA damage with HU or with the endonuclease HO, which reinforces the role of Pkc1 in the cellular response to DNA damage. Lambda phosphatase treatment determined that this change in the mobility is caused by phosphorylation and this phosphorylation is mediated by the checkpoint kinase Tel1. Moreover, Pkc1 and its kinase activity are necessary for checkpoint activation and Pkc1 regulates the Rad53 upstream kinases Mec1 and Tel1. The study of Pkc1 localization reveals that Pkc1 is delocalized from polarized sites after replication stress but no nuclear localization can be detected. In addition, Pkc1 is neither recruited to the lesion point, at least not in a stable way and a mutant in a nuclear localization signal (NLS) described for Pkc1 exhibits a normal Rad53 activation in response to DNA damage. Finally, the results obtained in yeast were extended to mammal PKCs. In yeast there is only one PKC, Pkc1, whereas in mammals there are 10 isoforms of the protein. Different isoforms were expressed in yeast with the objective to assign them the functions described for Pkc1 in yeast: its function in the maintenance of cell wall integrity, and the function, described in this work, related to the genome integrity. The results showed that expression of the mammalian PKCε in the yeast mutant strain pkc1 partially suppressed the growth defects of this mutant. This reveals that PKCε could have a biological activity related with Pkc1 playing an important role in cellular integrity and morphogenetic processes. On the other hand, the expression of the PKCδ isoform activates Rad53 in response to genotoxic stress in the pkc1 mutant which points that PKCδ would have a biological activity related to the maintenance of the genome integrity of Pkc1. Finally the reduction of PKCδ activity also affected the activation of the Rad53 homolog in human cells, Chk2, which indicates that PKCδ is also necessary for the proper checkpoint activation in response to DNA damage in human cells.La principal función de la ruta de la Proteína Quinasa C (PKC) en Saccharomyces cerevisiae es asegurar la integridad de la pared celular. En este trabajo se ha descrito que proteínas de la ruta PKC como la MAP quinasa Slt2 y la quinasa Pkc1 son importantes en la respuesta celular a daño en el DNA y además se han extendido los estudios a las PKCs de mamíferos. Respecto al papel de Slt2 en el metabolismo del DNA se ha visto que el mutante slt2 presenta hipersensibilidad a gran variedad de agentes genotóxicos como la hidroxiurea (HU), el metilmetanosulfonato (MMS), fleomicina (Phleo) o radiación ultravioleta (UV). Además, Slt2 es activado por todos estos tratamientos, lo cual sugiere que Slt2 juega un papel central en la respuesta celular al estrés genotóxico. La activación de Slt2 no depende del checkpoint de integridad del DNA; de hecho, se observa una fuerte activación basal en los mutantes del checkpoint lo que revela conexiones funcionales entre la MAP quinasa y proteínas del checkpoint. La activación de Slt2 por MMS y UV requiere la progresión a través del ciclo celular. Por el contrario, el tratamiento con HU es capaz de activar a Slt2 en células post-replicativas paradas en G2/M, lo que sugiere que Slt2 podría estar respondiendo a alteraciones de los niveles de dNTP. Sin embargo, ni los niveles de proteína de las distintas subunidades de la ribonucleótido reductasa (RNR) ni la concentración de dNTPs se ven afectados en una cepa mutante slt2. Por otro lado, el análisis de la funcionalidad del checkpoint revela que Slt2, así como proteínas que presentan funciones redundantes con Slt2 como la pseudo-quinasa Mlp1 y la MAP quinasa Hog1, no son necesarias para la activación de la quinasa del checkpoint Rad53 en respuesta a daño en el DNA y además Slt2 tampoco es necesario para la parada del ciclo celular inducida por MMS o HU. Sin embargo, en presencia de estrés replicativo las células mutantes slt2 presentan yemas anormalmente hiperpolarizadas debido a fallos en la degradación de la quinasa inhibidora de la CDK Swe1, lo que indica que Slt2 contribuye al control de la morfogénesis de la yema cuando se induce estrés genotóxico. En relación a la conexión de Pkc1 con la respuesta a daño en el DNA se observa que al igual que slt2, los mutantes pkc1 presentan hipersensibilidad a HU, MMS, Phleo y radiación UV. Además la proteína Pkc1 experimenta un retraso en su movilidad electroforética tanto después de tratar las células con HU como después de inducir una rotura cromosómica de la doble cadena con la endonucleasa HO, lo que refuerza el papel de Pkc1 en la respuesta celular a daño en el DNA. Mediante tratamiento con fosfatasa lambda se ha determinado que el cambio electroforético experimentado por Pkc1 en presencia de estrés genotóxico es probablemente debido a la fosforilación de la proteína siendo la quinasa del checkpoint Tel1 necesaria para dicha fosforilación. Se ha determinado también que la actividad quinasa de Pkc1 es necesaria para que Rad53 se active por estrés genotóxico lo que evidencia que Pkc1 actuaría fosforilando a dianas con importante función en la activación del checkpoint. Respecto a qué nivel de la ruta del checkpoint actúa Pkc1 se ha conseguido determinar que Pkc1 controla a las quinasas del checkpoint Mec1 y Tel1 situadas por encima de Rad53. Los estudios de localización de Pkc1 revelan que en presencia de HU, Pkc1 deja de localizarse en sitios de crecimiento polarizado, aunque no se ha podido determinar si cambia su localización al núcleo o se reclute a la zona de la lesión, y de hecho la mutación de la señal de localización nuclear (NLS) descrita para Pkc1 no afecta a la activación de Rad53 por daño en el DNA. Finalmente se han extendido los estudios a las PKCs de mamíferos. Mientras que en levadura existe una única PKC, Pkc1, en mamíferos la superfamilia de las PKCs está formada por 10 isoformas distintas. Las diferentes isoformas se han expresado en levadura con el objetivo de asignarles funciones ya descritas para Pkc1 de levadura como son la conocida función en integridad celular y la función descrita en este trabajo en relación a la integridad del DNA. Los resultados obtenidos muestran por un lado que la expresión de la isoforma PKCε de mamíferos en la cepa mutante pkc1ts de levadura complementa, aunque parcialmente, los defectos de crecimiento de este mutante pero no los fallos en el checkpoint, lo que evidencia que PKCε podría tener una actividad biológica relacionada estrechamente con Pkc1 jugando un papel importante en procesos morfogenéticos y de integridad celular. Por otro lado, la expresión de la isoforma PKCδ de mamíferos suprime el defecto en la activación de Rad53 por daño genotóxico del mutante pkc1 pero no los defectos de crecimiento, lo que indica que PKCδ tendría una actividad biológica relacionada estrechamente con Pkc1 pero en relación a su papel en el mantenimiento de la integridad del genoma. Finalmente el hecho que en células humanas se vea también afectada la activación por daño en el DNA de la quinasa del checkpoint Chk2 cuando se reduce la actividad PKCδ evidencia que PKCδ es necesaria para la correcta activación del checkpoint en células humanas