Estudio de la expresión del sistema fibrinolítico y del sistema de las metaloproteasas en el cáncer de mama.

The plasminogen activation system and matrix metalloproteinases (MMPs) play a key role in the degradation of basement membrane and extracellular matrix in tissue remodeling, cancer cell invasion and metastasis. It is generally believed that uPA initiates a proteinase cascade at the cell surface that contributes to tumor invasion, metastasis and angiogenesis. uPA is inhibited by plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1) and it can also be inhibited by PAI type-3 (PAI-3). On the other hand, MMPs are involved in several pathological processes, including tumor invasion, in which degradation of the extracellular matrix is a key event. MMP-3 is a stromelysin implicated in invasion and metastasis processes. MMP-3 activity is regulated by tissue inhibitors of metalloproteinases type-1 (TIMP-1). The quantitative real-time RT-PCR technique allowed us to obtain a highly sensitive, specific, and reproducible mRNAs quantification of uPA, PAI-1, PAI-3, MMP-3 and TIMP-1. PAI-1, uPA and TIMP-1 mRNA and antigen levels and PAI-1 and uPA functional levels increased with tumor severity, and in node-positive patients than those who were node-negative. However, no significant variations were observed for PAI-3 and MMP-3 for all the groups studied. PAI-3 antigen levels were significantly higher in early relapse-free patients than in patients who suffered a relapse. However, PAI-1 and MMP-3 antigen levels were significantly higher in patients who suffered an early relapse than in those who did not . uPA immunoreactivity was localized mainly in stromal and endothelial cells and with lower intensity in cancer cells. PAI-1 immunostaining was stronger in cancer cells and in endothelial cells, than in stromal cells surrounding cancer cells. PAI-3 antigen was localized in the stromal cells surrounding nested cancer cells, but it was not observed in cancer cells or in endothelial cells. uPA and PAI-1 mRNA was localized mainly in stromal cells, indicating that uPA and PAI-1 are mainly synthesized by stromal cells, secreted and captured by cancer cells. We have found, for the first time, that PAI-3 is expressed in breast cancer tissue. Our data indicated that uPA, PAI-1, MMP-3 and TIMP-1 are implicated in invasion and metastasis in breast cancer. However, PAI-3 seems to inhibit these processes.RESUMEN El cáncer de mama es el tumor más frecuente en la mujer occidental y su incidencia ha aumentado desde hace unos 50 años. Se ha descrito, que tanto el sistema fibrinolítico como el sistema de las metaloproteasas (MMPs) juegan un importante papel en la enfermedad neoplásica, participando, fundamentalmente, en la degradación de la matriz extracelular (MEC), proceso que es requerido para que tenga lugar la invasión, la migración y la metástasis tumoral. El sistema fibrinolítico tiene como base la activación del plasminógeno a plasmina, enzima que participa en múltiples procesos biológicos y patológicos. Esta transformación es llevada a cabo, entre otros, por la acción proteolítica del activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA). Su principal inhibidor es el inhibidor del activador del plasminógeno de tipo 1 (PAI-1), pero también puede ser inhibido por el inhibidor tipo 3 (PAI-3). El sistema de las MMPs está formado por un conjunto de encimas zinc dependientes, que colectivamente son capaces de degradar la mayoría de los componentes de la MEC. En el presente estudio, se analizó la MMP-3 y su principal inhibidor el TIMP-1. En este trabajo se han cuantificado los niveles antigénicos y funcionales de estos componentes en tejido de cáncer de mama. Además, se ha puesto a punto la técnica de la RT-PCR cuantitativa en tiempo real, para cuantificar los niveles de mRNA de uPA, PAI-1, PAI-3, MMP-3 y TIMP-1. Por otro lado, se determinó la localización antigénica de uPA, PAI-1 y PAI-3 en tejido de cáncer de mama, mediante la técnica de inmunohistoquimia y la localización del mRNA de uPA y PAI-1 mediante la técnica de hibridación in situ. Los resultados obtenidos indican que la técnica de la RT-PCR cuantitativa en tiempo real es altamente sensible, reproducible y específica para la cuantificación del mRNA uPA, PAI-1, PAI-3, MMP-3 y TIMP-1. Por otro lado, se obtuvo que los niveles antigénicos y de mRNA de uPA, PAI-1 y TIMP-1 los niveles funcionales de uPA, aumentaron significativamente con la gravedad del tumor y, también, estaban significativamente aumentados en tejido de pacientes con afectación ganglionar con respecto a pacientes sin afectación. Sin embargo, ni los niveles de PAI-3 ni los de la MMP-3, variaron significativamente entre estos grupos. Cuando se analizó el papel de estos componentes en la recaída se observó que los niveles antigénicos de PAI-1 y MMP-3, estaban significativamente aumentados en pacientes con recaída. Sin embargo, los niveles antigénicos de PAI-3, estaban significativamente aumentados en pacientes libre de enfermedad. En cuanto a la localización antigénica, se observó que la proteína de uPA se expresa con mayor intensidad en las células del estroma que en las cancerosas. La proteína de PAI-1 se localiza fundamentalmente en las células cancerosas y en las endoteliales, siendo su señal de menor intensidad en las células del estroma. Mientras que el PAI-3, se encuentra exclusivamente, en las células del estroma que rodean a las tumorales. Por otro lado, la síntesis de mRNA de uPA y PAI-1 se localizó, fundamentalmente, en las células del estroma que rodean a las cancerosas. Lo que sugiere que el uPA y PAI-1 son sintetizados, principalmente, por las células del estroma y, posteriormente, son captadas por las células cancerosas. En la presente tesis, se ha descrito, por primera vez, que el PAI-3 es expresado en tejido de cáncer de mama. Por otro lado, los resultados obtenidos sugieren que el uPA, PAI-1, MMP-3 y TIMP-1 favorecerían los procesos de invasión y metástasis en el cáncer de mama. Sin embargo, el PAI-3 podría inhibir estos procesos. ___________________________________________________________________________________________________