Detectie van Cryptosporidium oocysten en Giardia cysten in water met een Becton Dickinson FACSort flow cytometer

De huidige methode die in de Verenigde Staten, Groot- Brittannie en Nederland wordt gebruikt voor de detectie van Cryptosporidium en Giardia in water bestaat uit een combinatie van filtratie, concentratie door centrifugeren en flotatie en immuunfluorescentie microscopie. De methode is zeer arbeidsintensief en inefficient. Tijdens het opwerken van de monsters gaan veel (oo)cysten verloren; dit resulteert in een gemiddelde overall recovery van ongeveer 3% in monsters oppervlaktewater. Interpretatie van de microscopische preparaten is zeer tijdrovend en bovendien wordt hinder ondervonden van het in de preparaten aanwezige debris. In dit onderzoek werd de huidige methode verbeterd door gebruik te maken van fluorescence activated cell-sorting met een flow-cytometer. Hiertoe werd de FACSort flow cytometer ingepast in de huidige methode om de (oo)cysten van Cryptosporidium en Giardia uit concentraten van rivierwater, rioolwater en secundair effluent te zuiveren. De (oo)cysten werden gekleurd met FITC-gelabelde monoclonale antilichamen en op basis van hun fluorescentie en forward-scatter eigenschappen gesorteerd op een 13 mm polycarbonaat membraanfilter. 28 milieu monsters (inclusief 10 kunstmatig besmette monsters) werden onderzocht met zowel de standaard methode als de methode met de FACSort. De FACSort bleek zeer gebruikersvriendelijk en gemakkelijk te bedienen en verbeterde de prestaties van de standaard methode. Met de FACSort was 96% van de monsters positief voor Giardia (geometrisch gemiddelde 8,6 cysten/l), met de standaard methode was dit 86% (geom. gem. 4,1 cysten/l). In 22/25 monsters die met beide methoden werden onderzocht detecteerde FACSort 14 ( range 1,2-84) maal zo veel cysten als de standaard methode. Verschillen tussen de beide methoden zijn significant (PCurrent detection techniques for Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water samples combine filtration of large volumes of water, concentration by centrifugation and flotation and immunofluorescense microscopy. The techniques are extremely labour-intensive and inefficient. The various steps in the sample processing procedures cause large losses of (oo)cysts resulting in an average overall recovery of about 3% in surface water samples. Microscopic interpretation of concentrates is time consuming and difficult due to the presence of debris. We used fluorescence activated cell-sorting with a flow cytometer prior to fluorescence microscopy in order to improve our standard method. We therefore incorporated the FACSort flow cytometer prior to epifluorescence microscopy in our current detection method to purify Cryptosporidium and Giardia (oo)cysts in concentrated river water, sewage water and secondary effluent samples. The (oo)cysts were stained with FITC-conjugated monoclonal antibodies and sorted by the FACSort on the basis of fluorescence and forward scatter characteristics on a 13 mm polycarbonate membrane filter. 28 environmental samples (including 10 seeded samples) were examined with both our standard method and the method with the FACSort flow cytometer. The FACSort flow cytometer proved to be user-friendly and easy to operate and it improved the performance of the standard method. With FACSort 96% of the samples were positive for Giardia, the geometric mean was 8.6 cysts per liter. The standard method detected Giardia cysts in 86% of the samples with a geometric meam of 4.1 cysts per liter. In 22/25 samples that were examined with both methods FACSort detected 14 (range 1.2-84) times as many cysts per liter as the standard method. Differences between FACSort and standard are significant (PDGM/DW