Detection of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water samples with a Becton Dickinson FACSort flow cytometer

De huidige methode die in de Verenigde Staten, Groot- Brittannie en Nederland wordt gebruikt voor de detectie van Cryptosporidium en Giardia in water bestaat uit een combinatie van filtratie, concentratie door centrifugeren en flotatie en immuunfluorescentie microscopie. De methode is zeer arbeidsintensief en inefficient. Tijdens het opwerken van de monsters gaan veel (oo)cysten verloren; dit resulteert in een gemiddelde overall recovery van ongeveer 3% in monsters oppervlaktewater. Interpretatie van de microscopische preparaten is zeer tijdrovend en bovendien wordt hinder ondervonden van het in de preparaten aanwezige debris. In dit onderzoek werd de huidige methode verbeterd door gebruik te maken van fluorescence activated cell-sorting met een flow-cytometer. Hiertoe werd de FACSort flow cytometer ingepast in de huidige methode om de (oo)cysten van Cryptosporidium en Giardia uit concentraten van rivierwater, rioolwater en secundair effluent te zuiveren. De (oo)cysten werden gekleurd met FITC-gelabelde monoclonale antilichamen en op basis van hun fluorescentie en forward-scatter eigenschappen gesorteerd op een 13 mm polycarbonaat membraanfilter. 28 milieu monsters (inclusief 10 kunstmatig besmette monsters) werden onderzocht met zowel de standaard methode als de methode met de FACSort. De FACSort bleek zeer gebruikersvriendelijk en gemakkelijk te bedienen en verbeterde de prestaties van de standaard methode. Met de FACSort was 96% van de monsters positief voor Giardia (geometrisch gemiddelde 8,6 cysten/l), met de standaard methode was dit 86% (geom. gem. 4,1 cysten/l). In 22/25 monsters die met beide methoden werden onderzocht detecteerde FACSort 14 ( range 1,2-84) maal zo veel cysten als de standaard methode. Verschillen tussen de beide methoden zijn significant (P<0,05). FACSort detecteerde Cryptosporidium in 74% van de monsters (geom. gem. 0,95 oocysten/l), terwijl de standaard methode dat in 64% van de monsters deed (geom. gem. 0,38 oocysten/l). FACSort vond 17 (range 1,1-91) maal zo veel oocysten in 15/27 monsters die met beide methoden werden onderzocht ; de verschillen tussen de beide methoden zijn echter niet significant. Met de FACSort werden (oo)cysten op membraanfilters gesorteerd ; de verkregen preparaten waren erg schoon en makkelijk te beoordelen, waardoor de tellingen betrouwbaarder werden. Bij sorteren op membraanfilters met een diameter van 13 mm kon de tijd nodig voor microscopische beoordeling met ca. 70% gereduceerd worden. De overall recovery van beide methoden is relatief laag. Met FACSort werd voor Giardia een recovery van 17,1% behaald, voor Cryptosporidium bedroeg de recovery 5,9%. De standaard methode vond 15,6% van de cysten en 2,9% van oocysten terug. De lage overall recovery is niet te wijten aan de FACSort ; deze vindt 95% van de oocysten in een suspensie terug. De monster opwerk procedure die voor beide methoden gelijk is kent echter een aantal stappen die een aanzienlijk verlies van (oo)cysten veroorzaken. Er worden een aantal aanbevelingen gedaan om het onderscheidend vermogen van de FACSort te verbeteren door andere monoclonale antilichamen of fluorochromen te gebruiken, om de microscopische bevestiging te laten vervallen. De recovery van de totale opwerkings procedure kan verhoogd worden als flow cytometrie gekoppeld wordt met flocculatie met calciumcarbonaat. Gesorteerde monsters die naast (oo)cysten weinig debris bevatten zijn mogelijk ook geschikt voor het gebruik van technieken die de levensvatbaarheid van (oo)cysten vaststellen. Levensvatbaarheid is het belangrijkste criterium bij het bepalen van de gevolgen van (oo)cysten uit het milieu voor de volksgezondheid.<br&gt