Biotechnological production of PHA by selected thermophilic bacteria

Hlavními tématy této závěrečné práce jsou produkce PHA kopolymerů a studium metabolismu termofilního rodu Aneurinibacillus. Teoretická část se z velké části zaobírá obecnými vlastnostmi a vznikem PHA, dále pak bakteriemi produkujícími PHA, zejména extrémofily, a poslední kapitola je věnována konkrétně bakteriálnímu rodu Aneurinibacillus a dosavadním znalostem o těchto producentech PHA. Praktická část je zaměřena na testování PHA syntázy těchto bakterií, která vykazuje schopnost syntézy široké škály monomerů. S využitím kmenů AFN2 a AH30 byly syntetizovány různé neobvyklé kopolymery s obsahem 3HB, 3HV, 4HB, 4HV, 5HV, a dokonce i šestiuhlíkaté 3HHx a 4HHx. To vypovídá o velice rozsáhlé nespecifitě tohoto enzymu. Kopolymery byly syntetizovány díky přídavkům různých prekurzorů z řad laktonů, diolů a organických kyselin. Tyto prekurzory byly přidávány do minerálního média, které vytvářelo prostředí s limitujícím obsahem dusíku, nebo do komplexního média, které bakteriím poskytlo veškeré potřebné prvky v dostatečné koncentraci. PHA byly produkovány na obou zvolených médiích. Bakterie rodu Aneurinibacillus tedy pro syntézu PHA nevyžadují nutně prostředí s limitujícím obsahem dusíku. Za zmínku stojí výsledek kultivace kmene AFN2 na komplexním médiu s přídavkem glukózy a -valerolaktonu. Biomasa za těchto podmínek narostla do koncentrace 4,2 g/l a množství syntetizovaného PHA dosáhlo hodnoty 2,6 g/l. Tento kopolymer obsahoval bezmála 60 mol. % monomeru 4HB. V závěru experimentální části byly z testovaných prekurzorů vybrány dvě dvojice lakton-diol, které byly posléze mezi sebou porovnávány. PHA produkované na médiích s přídavky těchto prekurzorů byly následně izolovány a charakterizovány. Bylo u nich stanoveno monomerní složení a molekulová hmotnost. Kopolymery syntetizované v přítomnosti laktonů vykazovaly vždy vyšší hodnotu molekulové hmotnosti, což lze vysvětlit alkoholytickou aktivitou PHA syntázy bakterií rodu Aneurinibacillus.This thesis is mainly focused on the production of PHA copolymers and study of metabolism of the thermophilic genus Aneurinibacillus. Theoretical part mainly deals with general characterization and production of PHA and with PHA producing bacteria, especially the extremophiles. The last chapter talks about the bacterial genus Aneurinibacillus and previous knowledge about this PHA producer. The experimental part is focused on testing the PHA synthase from Aneurinibacillus, which can synthesize large scale of different monomers. The two bacterial isolates, AFN2 and AH30, were used to produce copolymers with unsusual monomers in their structure, such as 3HB, 3HV, 4HB, 4HV, 5HV and even 3HHx and 4HHx. This means that the PHA synthase has low substrate specifity. The production of copolymers was supported by adding precursors which encompass lactones, diols and organic acides. There were used two different types of medium. The mineral medium, which generate the environment with limited content of nitrogen, and complex medium, which provide to bacteria all required elements. It was observed that the genus Aneurinibacillus don´t require the nitrogen limitation to produce PHA. One of the most successful experiments was the cultivation of AFN2 on complex medium with added glucose and -valerolactone as precursor. The concentration of biomass was 4,2 g/l and the syntesized PHA reached 2,6 g/l. This copolymer was composed nearly of 60 mol. % monomer 4HB. In the last section of experimental part the two pair lacton-diol were selected to produce more PHA copolymer wich was later isolated and characterized. When the lactone was used as precursor, the resulting PHA copolymer reported higher molecular weight. This can be explained by alcoholytical activity of PHA synthase from bacterial genus Aneurinibacillus.