Toll-like receptor stimulation of monocytes and macrophages: molecular mechanisms and consequences for interacting with NK cells

Makrophagen und Monozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung infektiöser Pathogene und regulieren adaptive Immunreaktionen. Ihre Reaktivität wird u.a. über PRR wie z.B. TLR-4 ausgelöst. TLR-4 ist in der Lage bakterielles LPS zu erkennen. Nach Stimulation assoziiert dieser Rezeptor mit unterschiedlichen Adaptor Proteinen wie z.B. MyD88 oder TRIF, was zu einer Aktivierung von Signalmolekülen wie MAPK oder NF-kB führt. Die Stimulation mit LPS kann sowohl zu einer immunstimulatorischen als auch zu einer immunsuppressiven Makrophagenreaktion führen. Der genaue Hergang in der Signalkaskade der Makrophagen, der für dieses diametrische Verhalten verantwortlich ist, ist immer noch nicht vollständig aufgeklärt. Um die Effekte von LPS auf unterschiedliche Makrophagenpopulationen zu untersuchen, wurden Monozyten von gesunden Spendern mit GM-CSF und M-CSF in pro-inflammatorische Typ1 (M1) oder anti-inflammatorische Typ 2 (M2) Subpopulationen differenziert. Wie erwartet wiesen M1 Makrophagen hinsichtlich ihrer Zytokinproduktion (hohe Mengen an IL-12p40 und geringe Mengen an IL-10) und ihrer Oberflächenexpression (starke Expression von CD86 und MHC-Klasse- II) einen pro-inflammatorischen Phänotyp auf. Im Gegensatz dazu setzten M2 Makrophagen hohe Mengen an IL-10 und vernachlässigbare Mengen an IL-12p40 frei und besaßen eine geringere Oberflächenexpression von CD86 und MHC-Klasse-II im Vergleich zu M1 Makrophagen. Um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen aufzuklären, wurden Genbereichsanalysen mit M1 und M2 von drei unterschiedlichen Spendern durchgeführt. Unter den 50 Genen, welche in die TLR4 Signalkaskade involviert sein könnten, wurden nur TLR4 und das Adaptor Protein MyD88 unterschiedlich reguliert. Durch Westernblot Analysen konnte bestätigt werden, dass in M2 eine deutlich geringere MyD88 Expression vorhanden ist als in M1 Makrophagen. Die Untersuchungen intrazellulärer Signalmoleküle konnten zeigen, dass die Produktion von IL-12p40 über MyD88, MAPK (abgesehen von ERK) und NF-kB verläuft. Die Regulation von IL-10 in beiden Makrophagentypen wurde über unterschiedliche Signalwege vermittelt. In M1 konnte gezeigt werden, dass alle drei untersuchten MAPK Mitglieder die IL-10 Produktion beeinflussen, wohingegen in M2 nur p38 und zu einem geringen Teil auch MyD88 und NF-kB eine regulatorische Rolle zu spielen scheinen. Zusammenfassend deuten die Daten darauf hin, dass die gegensätzliche Regulation des Adaptor Moleküls MyD88 in pro- und anti-inflammatorischen Makrophagensubpopulationen dafür verantwortlich sein könnte, dass ein einfacher, nicht-polymorpher Rezeptor wie TLR4 sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Immunreaktionen in Makrophagen hervorrufen kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle von NKG2D bei der Interaktion von NK-Zellen und Monozyten untersucht. Humane Monozyten exprimierten MICA nach TLR Stimulation, jedoch nicht MICB oder ULBP 1-3. Die Expression war assoziiert mit einer Hochregulation von CD80 und MHC-Klasse-II, der Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine, einer Verringerung der Apoptoserate, jedoch nicht mit der Freisetzung von MIC Molekülen in löslicher Form. Die TLR induzierte Expression von MICA auf der Oberfläche von Monozyten wurde von autologen NK-Zellen erkannt, was durch die Internalisierung von NKG2D nachgewiesen werden konnte. Während die MIC Expression auf Monozyten nicht zu einer erhöhten Suszeptibilität der Monozyten für die NK-Zell-Zytotoxizität führte, stimulierten LPS behandelte Monozyten die IFN-g Produktion aktivierter NK-Zellen, welches wesentlich von der MICA-NKG2D Interaktion abhängig war. Es konnte keine verstärkte NK-Zell Proliferation oder Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen beobachtet werden, nachdem NK-Zellen mit LPS aktivierten Monozyten stimuliert worden waren. Diese Ergebnisse deuten an, dass die MICA-NKG2D Interaktion einen Mechanismus darstellt, durch welchen Monozyten und NK-Zellen direkt während einer Entzündungsreaktion im Menschen miteinander kommunizieren können. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass trotz weitreichender Forschungen auf dem Gebiet der Stimulation von Monozyten und Makrophagen durch LPS viele Mechanismen noch unklar sind und weitere Untersuchungen erforderlich sind, um die genauen Abläufe in diesen Zellen aufzudecken.Macrophages and Monocytes play an important role in combating infectious pathogens and regulating adaptive immune responses. Their reactivity is, among others, guided by pattern recognition receptors including TLR-4, which recognizes bacterial LPS. After stimulation, TLR-4 can associate with different adaptor proteins like e.g. MyD88 or TRIF leading to the activation of signaling molecules like MAPK or NF-kB. However, stimulation with LPS may result in equally impressive immunostimulatory and immunosuppressive macrophage responses. The signaling events responsible for this diametrical behavior are still not fully understood. To study the effects of LPS on different macrophage subsets we differentiated monocytes of healthy donors with GM-CSF and M-CSF into pro-inflammatory type 1 (M1) or anti-inflammatory type 2 (M2) subsets, respectively. As expected, upon LPS stimulation the pro-inflammatory M1 macrophages secreted low levels of the immunosuppressive cytokine IL-10 and high levels of IL-12p40. In addition, these cells showed a high expression of CD86 and MHC-class-II. In contrast, M2 Macrophages produced neglectable amounts of IL-12p40 but high levels of IL-10. The expression of CD86 and MHC-class-II was found to be reduced compared to M1. To elucidate the underlying molecular mechanisms we performed gene array analyses with M1 compared to M2 from three independent donors. Interestingly, among over 50 genes involved in TLR-4 signaling, only TLR-4 itself and its adaptor protein MyD88 were found to be differentially regulated: Within the immunosuppressive M2 subset, MyD88 was significantly down regulated, while a significant upregulation of TLR-4 was observed compared to the immunostimulatory M1 subset. The alteration of MyD88 expression was further confirmed on protein level by western blot analyses. The analyses of intracellular signaling molecules with specific inhibitors demonstrated that MyD88, MAPK (apart from ERK) and NF-kB were involved in the production of IL-12p40. This indicates that in both macrophage subsets different signaling pathways could be responsible for the production of IL-10. All three MAPK members influence the production of IL-10 in M1 macrophages, whereas only p38 and partially MyD88 and NF-kB seem to play a regulatory role in M2 macrophages. In conclusion, our data suggest that the opposite regulation of the adaptor molecule MyD88 in pro- and anti-inflammatory macrophage subsets is responsible for the fact that a single, non-polymorphic receptor like TLR4 can mediate both pro- and anti-inflammatory immune responses in macrophages. In the second part of this work the interaction of monocytes with NK cells upon TLR-induced expression of the NKG2D ligand MICA was investigated. Upon TLR triggering human monocytes upregulated MICA, but not other ligands for the activating immunoreceptor NKG2D like MICB or ULBP1-3. MICA expression was associated with CD80, MHC-class-II upregulation, secretion of pro-inflammatory cytokines, and apoptosis inhibition, but was not influenced by the release of MIC molecules in soluble form. TLR-induced MICA on the monocyte cell surface was detected by autologous NK cells as revealed by NKG2D downregulation. While MICA expression did not render monocytes susceptible for NK cell cytotoxicity, LPS-treated monocytes stimulated IFN-g production of activated NK cells which was substantially dependent on MICA-NKG2D interaction. No enhanced NK cell proliferation or cytotoxicity against bystander cells was observed after stimulation of NK cells with LPS-activated monocytes. Our data indicate that the MICA-NKG2D interaction represents a mechanism by which monocytes and NK cells as an early source of IFN-g may communicate directly during an innate immune response to infectious pathogens in humans