Characterization of the guidance activity of ephrinA5 in vitro in different species (frog, fish, chick)

In dieser Arbeit sollte die Rolle von EphrinA5 beim Aufbau der retinotektalen Projektion charakterisiert werden. Seit langem sind Lenkungsmoleküle bekannt, die Axonen bei der Wegfindung in ihre korrekten Terminationszonen helfen. 1995 wurde EphrinA5 isoliert, das an Lenkungsprozessen beteiligt zu sein scheint. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob EphrinA5 in vitro Axone in ihrer Wachstumsrichtung beeinflussen kann. Beobachtet wurden retinale Ganglienzellwachstumskegel von Huhn, Xenopus und Zebrafisch. In allen drei Spezies konnte EphrinA5 eine Richtungsänderung der Axone induzieren. Nachgewiesen werden konnte diese Lenkungsfunktion in verschiedenen Experimenten: im Streifentest, im Lenkungstest mit beschichteten Kügelchen und im Diffusionsgradienten löslicher Proteine. Zur Aufklärung des Lenkungsmechanismus wurden Experimente mit EphrinA5-beschichteten Kügelchen durchgeführt. Es ergab sich eine konzentrations- und substratabhängige Lenkung. Weitere Versuche zeigten, dass der Axonschaft bei der Lenkung des Wachstumskegels kaum beteiligt zu sein scheint, denn eine Reizung des Axonschaftes war nicht ausreichend, eine Richtungsänderung zu induzieren. Eine gleichzeitige Reizung mit zwei Kügelchen auf der gleichen oder auf verschiedenen Seiten des Wachstumskegels führte jeweils zu einer stark erhöhten Kollapsreaktion, Lenkung konnte nicht beobachtet werden. In allen Testsystemen traten sowohl Kollaps als auch Lenkung auf. Aufgrund dieser Beobachtung wurde ein Lenkungsmechanismus für EphrinA5 bei der Bildung der retinotektalen Projektion des Hühnchens vorgeschlagen. Er beruht auf einer Bifunktionalität des EphrinA5: es kann Lenkungs- und Stoppfunktion ausüben, je nach Ephrinkonzentration und der zeitlichen Dauer der Exposition. Mit Hilfe dieses Modells können viele der in vitro gewonnenen Ergebnisse erklärt werden. Eine Relevanz dieses Modells in vivo muss noch bestätigt werden. Die anfängliche Entstehung der Projektion kann jedoch damit erklärt werden.The aim of this work was to characterize the role of ephrinA5 in the establishment of the retinotectal projection. Some years ago guidance molecules were found, which help the axons to find the pathway to their correct termination zones. In 1995 ephrinA5 was isolated which seemed to be such a guidance molecule. In this work we want to test if ephrinA5 could induce a turning behaviour in vitro. We observed reactions of retinal ganglion cell growth cones of three different species: chick, Xenopus and zebrafish. We found that ephrinA5 could induce a turning reaction in axons of all three species. We could confirm this guidance function in three different in vitro assays: in the stripe-assay, with ephrinA5-coated beads and in the diffusion gradient of soluble proteins. The turning of axons was substrate-dependent, attraction could be converted into repulsion by changing the substrate. To learn more about the guidance mechanism of ephrinA5 we performed different experiments with ephrinA5-coated beads. We could see a substrate- and dose-dependent turning behaviour of axons. Other experiments showed that the axon shaft does not participate in guiding axons because placing the beads in contact with the axon shaft did not result in turning of the growth cones. Simultaneous irritation with two beads either on the same or on different sides of the growth cones revealed high collapse rates, but no turning. In all assays both collapse and turning reaction could be observed. Therefore we propose a guidance mechanism for ephrinA5 in the retinotectal projection in chick. EphrinA5 is a bifunctional protein: it could either exert a guidance function or a stop function depending on the ephrinA5-concentration and/or the temporal exposition to the protein. With this model many results of in vitro experiments could be explained, although the relevance of this model in vivo has to be proven. The initial projection of the axons however could be explained with this model