Studies on the posttranscriptional regulation of the CDK inhibitors p27Kip1 and p21Cip1

Die intrazelluläre Konzentration des CDK-Inhibitors p27Kip1 spielt eine kritische Rolle bei der Entscheidung zwischen Proliferation und Wachstumsarrest in der G1-Phase des Zellzyklus. Zur Analyse der translationalen Regulation von p27 wurde eine 2516 nt lange humane p27-cDNA kloniert. Transiente Transfektionen von HeLa-Zellen zeigten, daß die 575 nt lange 5'UTR an ihrem 5'-Ende ein Element von etwa 100 nt enthält, das die Translation eines Reportergens in G1-Zellen im Vergleich zu Zellen der S-Phase um den Faktor 2 bis 2,5 verstärkt. Dieses Element gewährleistet demnach eine translationale Regulation, wie sie die endogene p27-mRNA am Übergang von der G1- zur S-Phase erfährt. Es wurde daher als 'cell cycle responsive element' (CCRE) bezeichnet. Stromabwärts des CCRE wurde eine 'internal ribosomal entry site' (IRES) identifiziert, die es Ribosomen ermöglicht, die Translation von p27 unabhängig von der 5'-Cap-Struktur zu initiieren und vermutlich zur Aufrechterhaltung der p27-Expression in quieszenten Zellen beiträgt. Es wurde weiter gezeigt, daß RNA-Bindeproteine PTB (polypyrimidine tract binding protein) und Nucleolin in vitro spezifisch und unter stringenten Bedingungen an das CCRE binden. Die Überexpression von PTB reprimiert spezifisch die Reportergenexpression von Transkripten mit p27-5'UTR. Diese Beobachtungen stützen die Hypothese, daß PTB in vivo an der translationalen Regulation von p27 beteiligt sein könnte. Der CDK-Inhibitor p21Cip1 ist mit p27Kip1 nahe verwandt und wird unter anderem durch den Tumorsuppressor p53 als Reaktion auf DNA-Schäden induziert. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß p21 durch Cyclin A/CDK2 in vitro zu drei Phosphoisoformen unterschiedlicher elektrophoretischer Beweglichkeit umgesetzt werden kann. Es konnte weiter gezeigt werden, daß diese Phosphoisoformen als Monomere Cyclin A/CDK2 inhibieren und sich darin von unmodifiziertem p21 nicht unterscheiden.The intracellular level of CDK inhibitor p27Kip1 plays an important role in controlling the decision between proliferation and growth arrest during G1 phase. In addition to altered protein stability, translational control of p27 synthesis contributes to this regulation. In order to investigate the mechanisms of regulated translation of p27, an extended human p27 cDNA of 2516 nt was isolated. Using transient transfections of HeLa cells, an element of about 100 nt was identified at the 5' end of the 5'UTR, that causes a 2 to 2.5 fold increase of reporter mRNA translation in G1 cells when compared to S phase cells. This regulation is similar to the translational control of endogenous p27 mRNA at the G1/S transition. Therefore the 100 nt 5'UTR region was designated the cell cycle responsive element (CCRE). An internal ribosomal entry site (IRES) was identified downstream of the CCRE allowing ribosomes to initiate translation independent of the 5' cap structure. The IRES is likely to contribute to the maintenance of p27 expression in quiescent cells. Furthermore it was shown, that the RNA binding proteins PTB (polypyrimidine tract binding protein) und Nucleolin specifically bind to the CCRE in vitro under stringent conditions. Overexpression of PTB specifically represses reporter gene expression from transcripts with p27 5'UTR. These observations suggest that PTB participates in p27 translational control in vivo. The CDK inhibitor p21Cip1 is a close relative of p27Kip1 and is induced for example by the tumorsuppressor p53 in response to DNA damage. Here it was shown, that p21 is phosphorylated in vitro by its target kinase Cyclin A/CDK2. Three phosphoisoforms were observed with different electrophoretic mobilities. The isoforms with the lowest electrophoretic mobilities are likely to contain two or three phosphate groups respectively. It was demonstrated that these phosphoisoforms inhibit Cyclin A/CDK2 in a monomeric form as had been shown for unmodified p21