Expression and effect of erythropoietin ß in astrocytes under normoxic and hypoxic conditions

Hochregulation von GFAP in Astrozyten ist mit einer Abnahme der EPO-Expression, der Proliferation und des Überlebens der Zellen verbunden Erythropoietin (EPO) zeigt neurotrophische und neuroprotektive Wirkungen in verschiedenen in vivo und in vitro Modellen von Hirnschäden. In der vorliegenden Studie wurden Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen und Real-time-RT-PCR benutzt, um die Korrelation zwischen der GFAP-Expression und der Synthese von EPO sowie von "proliferative cell nuclear antigen" (PCNA) in jungen (Tag 7) und alten (Tag 21) astroglialen Zellkulturen zu untersuchen. Um zu untersuchen, welchen Einfluss EPO auf das Überleben von GFAP-positiven Zellen hat, wurde auch die humane astrozytäre Zelllinie SV-40 FHAS untersucht. Die Zahl der Zellen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen in EPO-freiem und EPO-angereichertem Zellkulturmedium wurde ebenfalls untersucht. Es zeigte sich eine inverse Korrelation zwischen der EPO-Produktion und der Expression von GFAP. Diese Ergebnisse wurden durch die RT-PCT-Untersuchungen, bei denen sich eine Abnahme der EPO-mRNA-Spiegel in den alten astroglialen Primärkulturen zeigten, bestätigt. Wie sich anhand der PCNA-Expession zeigte, sank die Proliferation während der Ausdifferenzierung der Astrozyten. Die Herunterregulation von EPO in Astrozyten, welche ihre Fähigkeit zur Proliferation und zur ausgeprägten GFAP-Expression, einem Protein, das das Zytoskelett der Zelle in pathologischen Situationen unterstützt, verloren haben, lässt annehmen, dass EPO eine Rolle beim Überleben von Astrozyten spielt. Um diese Frage näher zu beleuchten, wurden humane Astrozyten unter hypoxischen Bedingungen in Anwesenheit und zur Kontrolle in Abwesenheit von EPO kultiviert. Die Zugabe von EPO blockierte das massive Absterben der Zellen unter den hypoxischen Bedingungen. Es wurde daraus geschlossen, dass EPO eine Rolle beim Überleben und der Proliferation von Astrozyten spielt, und so wichtig bei Erkrankungen des Zentralnervensystems sein könnte.Upregulation of GFAP in astrocytes is associated with decreased expression of EPO, proliferation and survival of the cells. Erythropoietin (EPO) exerts neurotrophic and neuroprotective activities in different in vivo and in vitro models of brain damage. In the present study, we used double immunofluorescence technique and real time RT-PCR to examine the correlation between the expression of GFAP and the synthesis of EPO and proliferative cell nuclear antigen (PCNA) in early (day 7) and late (day 21) astroglial primary cultures. In order to examine the influence of EPO on the survival of GFAP-positive cells, the human astrocytic cell line SV-40 FHAS was studied. The number of the cells grown under hypoxic and normoxic conditions in EPO-free and EPO-supplemented medium was determined. There was an inverse correlation of the dynamics of EPO synthesis and the expression of GFAP. These results were confirmed by real time RT-PCR studies which showed decreased EPO-mRNA levels in late astroglial primary cultures. As judged from the expression of PCNA, proliferation decreased during the differentiation of astrocytes. Down-regulation of EPO in astrocytes which lost their capacity to proliferate and strongly expressed GFAP, a protein that supports the cytoskeleton of the cells during pathological situations, suggested a role for EPO in the survival of astrocytes. To address this question, human astrocytes were cultured under hypoxic conditions in the presence and as control in the absence of EPO. Addition of EPO blocked the massive disappearance of the cells under hypoxic conditions. In conclusion: EPO may be involved in the mechanisms regulating the survival and the proliferation of astrocytes, that might play an important role in diseases of the central nervous system