Regulation of endogenous Na+/K+-ATPase and heterologiously expressed K+-channels in Xenopus Oocytes by the Serum- und Glucocorticoid-induced Kinase SGK

EINLEITUNG/FRAGESTELLUNG: Die Serum- und Glucocorticoid-abhängige Kinase (SGK) wurde 1993 entdeckt. Als eine wichtige Rolle der SGK wurde die Vermittlung der Aldosteron-Wirkung auf den epithelialen Na+-Kanal (ENaC) im distalen Nephron und die damit verbundene Natriumretention erkannt. Mit der Stimulation des ENaC geht unter Aldosteron eine Stimulation der basolateral lokalisierten Na+/K+-ATPase und eine Zunahme von K+-Sekretion aus der Epithelzelle einher. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob auch diese Wirkungen von Aldosteron durch die SGK vermittelt werden. Bei der Untersuchung der Regulation der K+-Kanäle ROMK und Kv1.3 durch die SGK interessierte auch die Frage, ob an der Stimulation noch andere Proteine beteiligt sind. METHODEN: SGK, ROMK und Kv1.3 wurden heterolog in Oozyten des südafrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis exprimiert. Die Aktivitäten der endogenen Na+/K+-ATPase und der K+-Kanäle wurden mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme gemessen. ERGEBNISSE: Es konnte gezeigt werden, dass die SGK eine Stimulation der endogenen Na+/K+-ATPase von X. laevis Oozyten bewirkt. Diese Stimulation ließ sich elektrophysiologisch durch eine deutliche Steigerung des K+-induzierten und Ouabain-sensitiven Pumpstromes der Na+/K+-ATPase, sowie durch eine Zunahme der K+-induzierten Hyperpolarisation des Membranpotentials darstellen. Die SGK ist auch bei der Regulation des ROMK1 entscheident beteiligt. Allerdings ist hierbei die zusätzliche Expression von NHERF2 in den Oozyten notwendig. NHERF2 ist mit SGK und ROMK in den Hauptzellen des distalen Tubulus und des Sammelrohres kolokalisiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die SGK den Kv1.3 durch Verzögerung seines Abbaus aus der Zellmembran stimuliert. Die SGK hebt dabei die Wirkung der Ubiquitinligase Nedd4-2 auf. Nedd4-2 inaktiviert den Kv1.3 durch beschleunigten Abbau aus der Membran. ZUSAMMENFASSUNG: Die Ergebnisse zeigen, dass die SGK bei der renalen Elektrolytregulation eine Schlüsselrolle einnimmt, indem sie nicht nur den ENaC, sondern auch die Na+/K+-ATPase und zusammen mit NHERF2 den ROMK1 reguliert. Die Einbeziehung von NHERF2 für die Stimulation des ROMK1 und Nedd4-2 für die Stimulation von Kv1.3 macht die Wirkung der SGK auf die verschiedenen Zielproteine unabhängig voneinander. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, wie die SGK spezifische Wirkungen trotz eines breiten Spektrums an regulierten Proteinen erzielt.INTRODUCTION: The Serum- und Glucocorticoid-induced Kinase (SGK) was cloned 1993. It plays an important role in mediating the effect of aldosterone on the epithelial sodium channel (ENaC) in the renal tubule system. Upon stimulation of the ENaC upregulation of the basolateral Na+/K+-ATPase and luminal secretion of potassium takes place. This rises the question if besides stimulation of ENaC the SGK participates in the regulation of the Na+/K+-ATPase and luminal potassium channels. If this is the case the question arises if other molekules are required to mediate the the action of SGK. METHODS: SGK, ROMK and KV1.3 were heterologiously expressed in Oocytes of the South African frog Xenopus laevis. The activity of the endognous Na+/K+-ATPase and of the voltage gated potassium channel KV1.3 and renal outer medullary K+-channel ROMK were measured with Two-Electrode-Voltage-Clamp. RESULTS: The present study shows that SGK can stimulate the Na+/K+-ATPase. This effect was reflected by the enhanced hyperpolarisation and increased outwards current following the re-addition of K+ to the extracellular perfusate in the presence of the K+-channel blocker Ba2+. Both phenomena were completely dependent on Na+/K+-ATPase – activity, as both were completely abolished by the addition of ouabaine. The study further shows that SGK also participates in the regulation of ROMK. But in this case the additional expression of the Na+/H+-exchanger regulating factor 2 NHERF2 is necessary in the oocytes. Coexpression of ROMK together with either NHERF2 or SGK alone is not sufficient to stimulate the K+-channel. NHERF2 is colocalised with SGK and ROMK in the principal cells of the connecting tubule and the collecting duct. Concerning the voltage gated K+-channel KV1.3 it was shown that the SGK stimulates KV1.3 by enhancing its abundance in the plasma membrane. Coexpression of KV1.3 together with the ubiquitin ligase Nedd4-2 leads to down-regulation of the K+-channel by increased removal of channel protein from the plasma membrane. Previously it was shown that SGK phosphorylates and thereby inactivates Nedd4-2. Compatible with this result Coexpression of SGK together with Nedd4-2 and KV1.3 completely reversed the downregulation. SUMARY: The results of this study show that the serum and glucocorticoid induced kinase SGK plays a key role in renal electrolyte regulation. Besides stimulation of the epithelial sodium channel EnaC the SGK also upregulates the Na+/K+-ATPase and together with NHERF2 the luminal K+ channel ROMK. For the Stimulation of the voltage gated K+-channel KV1.3 by SGK we showed that inactivation of the ubiquitin lagase Nedd4-2 is involved. The inclusion of NHERF2 for the stimulation of the ROMK1 and Nedd4-2 for the stimulation of Kv1.3 makes effect the SGK on the different target proteins independent from each other. This could be a hint how the SGK achieves specific effects in spite of a wide spectrum in regulated proteins