Regulation of the store operated Ca2+ channel Orai1 and the Ca2+ sensitive protein STIM1 by the serum and glucocorticoid inducible kinase 1

Zelluläre Prozesse wie Differenzierung, Proliferation oder Apoptose werden durch Änderung der intrazellulären Ca2+-Konzentration beeinflusst. Die Mobilisierung von Ca2+ erfolgt aus dem Extrazellularraum oder aus internen Speichern wie dem Endoplasmatischen Retikulum (ER). Die Leerung des ER aktiviert einen Mechanismus, der als speicherabhängiger Ca2+-Eintritt (store-operated Ca2+ entry, SOCE) bezeichnet wird. Diesem Ca2+-Eintritt in die Zelle liegt ein für Ca2+-Ionen selektiver, anhaltend einwärts gerichteter Strom, der Ca2+-release-activated Ca2+ current (ICRAC), zugrunde. Für den Ablauf von SOCE/ICRAC spielen vor allem die Moleküle Stromal Interacting Molecule (STIM) 1 sowie Orai1 eine Rolle. Eine Zielstellung dieser Arbeit war es, die im PI3K-Signalweg vorkommende SGK1 hinsichtlich ihrer Regulierung des SOCE/ICRAC zu untersuchen. Der mit Hilfe der Fura-2-Imaging Methode gemessene Ca2+-Einstrom in Mastzellen, isoliert aus sgk1-/--Mäusen, ergab einen signifikant geringeren Ca2+-Einstrom im Vergleich zum Wildtyp. Weiterhin konnte in HEK293 Zellen, die eine konstitutiv aktive Mutante der SGK1 exprimierten, sowohl ein erhöhter Ca2+-Einstrom nach Leerung des ER als auch ein erhöhter ICRAC im Vergleich zu Kontrollzellen oder Zellen mit inaktiver Mutante der SGK1 gemessen werden. Ursächlich hierfür war eine Zunahme der Inkorporation von Orai1 in die Membran, hervorgerufen durch erniedrigte Degradierung des Proteins sowie erhöhtem mRNA-Level. Nach Bestätigung einer Ubiquitinierung von Orai1 konnte gezeigt werden, dass die Ubiquitinligase Nedd4-2, ein bekanntes negativ-reguliertes Zielprotein der SGK1, die Orai1-Proteinabundanz- und Inkorporation in die Membran erniedrigt, was einen verringerten SOCE/ICRAC zur Folge hat. Die Koexpression von Nedd4-2 und der aktiven SGK1-Mutante bzw. RNA-Interferenz gegen Nedd4-2 konnte SOCE/ICRAC durch Zunahme der Orai1-Proteinmenge erhöhen. Mastzellen aus SGK1-defizienten Mäusen zeigten zudem signifikant erniedrigte mRNA-Level für Orai1 und STIM1 verglichen mit Wildtyp-Mastzellen. Daher wurde der durch SGK1 regulierte Transkriptionsfaktor NF-kappaB näher untersucht. Durch Inhibierung von NF-kappaB oder -Untereinheiten in HEK293 Zellen mit Sulfasalazin, Wogonin oder nach RNA-Interferenz konnte eine Abnahme der mRNA-Level für Orai1 und STIM1 sowie von SOCE im Vergleich zu Kontrollzellen beobachtet werden. Entsprechend konnte durch Überexpression der NF-kappaB Untereinheiten eine Zunahme der mRNA- sowie Protein-Level von Orai1 und STIM1 als auch SOCE bestimmt werden. Tatsächlich wurden mit Hilfe des Reportergentests sowie Chromatin-Immunopräzipitation NF-kappaB-Bindungsstellen in den Promotoren für Orai1 und STIM1 identifiziert, die eine NF-kappaB sensitive Transkriptionsregulierung ermöglichen. Die SGK1 hat folglich einen wichtigen Einfluss auf den Ca2+-Eintritt und kann, wie in dieser Arbeit erstmals gezeigt wurde, durch zwei unterschiedliche Regulierungsmechanismen SOCE/ICRAC beeinflussen. Zum einen wird die Orai1-Proteinabundanz durch Nedd4-2 reguliert, zum anderen werden sowohl die Orai1- als auch die STIM1-Expression durch NF-kappaB beeinflusst. Die ermittelten Daten geben Aufschluss über die Regulierung von SOCE/ICRAC durch den PI3K-Signalweg, im Besonderen SGK1, und tragen zum Verständnis der Ca2+-Homöostase bei. Dies ermöglicht im Weiteren ein besseres Verständnis von Tumorwachstum im Zusammenhang des PI3K-Signalweges und SOCE/ICRAC.Cellular processes like differentiation, proliferation or apoptosis are influenced by intracellular changes in Ca2+ concentrations. Ca2+ can enter the cell from the extracellular space or internal stores like the endoplasmatic reticulum (ER). Emptying the ER activates a mechanism known as store operated Ca2+ entry (SOCE). Recently the key player- the stromal interacting molecule (STIM1) and Orai1 have been identified. One goal during this work was to determine the role of regulation of SOCE by in the PI3K-pathway occuring SGK1. Fura-2-Imaging showed a significant reduced Ca2+ entry in mast cells (BMMCs) isolated from sgk1-/- mice compared to their wildtype littermates. Additionaly HEK293 cells expressing a constitutively active SGK1 showed significantly increased SOCE and ICRAC compared to control cells or HEK293 cells expressing a constituvely inactive SGK1. This was due to an increase of Orai1 membrane incorporation evoked by a reduced degradation of Orai1 protein as well as increased mRNA-levels. It is shown that the ubiquitin ligase Nedd4-2, a known negatively regulated protein by SGK1, downregulates the Orai1 protein abundance and membrane incorporation. This in turn leads to lower SOCE/ICRAC. Coexpression of Nedd4-2 and the active SGK1 mutant or Nedd4-2 RNA interference respectively could increase SOCE/ICRAC due to increasement of Orai1 protein abundance. Furthermore, BMMCs from SGK1 deficient mice had signifcantly reduced mRNA levels for STIM1 and Orai1 compared to their wild type littermates. Inhibition of NF-kappaB or subunits in HEK293 cells with sulfasalazin, wogonin or RNA-interference, respectively, led to a decline in the mRNA levels of STIM1 and Orai1 as well as SOCE. Accordingly overexpression of NF-kappaB subunits increased mRNA- and protein levels of STIM1 and Orai1 as well as SOCE. Additionaly NF-kappaB binding sites could be identified by reportergen analysis and chromatin immunoprecipitation allowing for NF-kappaB sensitive regulation of transcription. Hence SGK1 plays an important role in Ca2+ entry into the cell and can, as demonstrated in this work, influence SOCE/ICRAC by two different mechanisms. On the one hand, Orai1 protein abundance is regulated by Nedd4-2, on the other hand STIM1 and Orai1 expression are influenced by NF-kappaB. The data provide a better understanding about the regulation of SOCE/ICRAC and Ca2+ homöostasis by the PI3K-signalling pathway, especially SGK1. This might further lead to a better appreciation of tumor growth cohesive with PI3K signalling and SOCE/ICRAC