Monitoring, mechanisms and management of insecticide resistance and insecticide mode of action in coleopteran pests of winter oilseed rape with special reference to neonicotinoid insecticides under laboratory and applied aspects

Winter oilseed rape, Brassica napus L., has become a vital part of cereal-based crop rotations in Europe. It is attacked by numerous insect pests and their control relies on the intensive use of insecticides (compared to other broad acre crops). The exclusive and continuous use of pyrethroid insecticides for almost twenty years led to an enormous selection pressure and facilitated the development of resistance in oilseed rape pests in Europe. Unsurprising three out of the five major pests of the order Coleoptera are reported to be pyrethroid resistant at present: the pollen beetle, Meligethes aeneus F.; the cabbage stem flea beetle, Psylliodes chrysocephala L. and the cabbage seed weevil, Ceutorhynchus assimilis PAYK.. An adult vial bioassay, which is based on insecticide coated glass vials, was used to monitor the spread and strength of pyrethroid resistance and to determine cross-resistance pattern in pollen beetle and cabbage stem flea beetle. Furthermore, baseline susceptibility towards lambda-cyhalothrin (a widely used pyrethroid) was also established for the cabbage seed weevil. The vial bioassay methodology was adapted to thiacloprid, a neonicotinoid insecticide, to determine baseline susceptibility and to provide a methodology to allow long-term susceptibility monitoring of pollen beetle and cabbage seed weevil. Thiacloprid monitoring revealed that pollen beetle and cabbage seed weevil populations collected across Europe in 2009-2012 and 2012 respectively were highly susceptible to this insecticide class. Metabolism studies using native microsomal preparations as the enzyme source and deltamethrin as substrate revealed metabolism of deltamethrin with 4-OH-deltamethrin being the major metabolite. Metabolite formation in vitro was correlated with the observed pyrethroid resistance level in vivo and was suppressible by PBO. A degenerate PCR approach was used to identify partial P450 gene sequences from pollen beetle. qRT-PCR screening covering a range of pollen beetle populations differing in levels of pyrethroid resistance identified a single P450, CYP6BQ23, as significantly and highly overexpressed (up to ~900-fold) in resistant strains compared to susceptible strains. The expression of CYP6BQ23 was significantly correlated with both the level of resistance and with the rate of deltamethrin metabolism in microsomal preparations of these populations. Recombinant expression of this P450 in an insect cell line demonstrated that it is capable of hydroxylating deltamethrin and tau-fluvalinate. The turnover of these pyrethroids by CYP6BQ23 is in line with the observed moderate cross-resistant phenotype. Molecular modeling suggested a better fit of deltamethrin into the active site of CYP6BQ23 compared to tau-fluvalinate also supporting the biochemical results. The occurrence of target-site resistance was investigated by single nucleotide polymorphism (SNP) analysis of the para-locus encoding the voltage-gated sodium channel (VGSC) in insects. To achieve this goal a partial fragment (domain IIS4-6) encoding an important region of the pyrethroid binding site was PCR amplified and screened for non-synonymous SNPs. One SNP was identified causing a leucine to phenylalanine substitution at amino acid residue number 1014 (Musca domestica L. numbering), well known as knock down resistance (kdr) conferring an absolute cross-resistance to pyrethroids and DDT in various insect species. Sequencing of the very same gene region in the cabbage stem flea beetle also revealed the presence of the L1014F kdr mutation in pyrethroid resistant flea beetle populations, thus explaining the strong cross-resistance pattern observed in vitro. Most mechanistic studies of resistance have focused on elucidating the contribution of particular genes/gene families to pyrethroid resistance. To generate a comprehensive sequence resource and to elucidate global changes in gene regulation related to insecticide resistance in pollen beetle a de novo transcriptome was assembled from sequence pools generated by next-generation sequencing. RNA-sequencing of three pyrethroid resistant and one highly susceptible reference population allowed a global gene expression analysis by short read mapping against the generated transcriptome, as well as a SNP analysis. The implications of these results for resistance management in coleopteran pests in winter oilseed rape and opportunities for future work are discussed.Der Winterraps, Brassica napus L., hat sich in Europa zu einem festen Bestandteil der maßgeblich von Getreide dominierten Fruchtfolgen entwickelt. Winterraps wird von einer Vielzahl an Schädlingen befallen welche in der Praxis fast ausschließlich durch den Einsatz von chemischen Insektiziden (maßgeblich Pyrethroide) bekämpft werden. Der seit mehr als 20 Jahren wiederkehrende Einsatz von Pyrethroiden zur Kontrolle von Rapsschädlingen in Europa resultierte in einem enormen Selektionsdruck. Vor diesem Hintergrund ist es nicht verwunderlich, dass drei Schädlinge der Ordnung Coleoptera gegenwärtig eine Resistenz gegen Pyrethroide aufweisen. Bei den drei coleopteren Vertretern handelt es sich um den Rapsglanzkäfer, Meligethes aeneus F., den Rapserdfloh, Psylliodes chrysocephala L. und den Kohlschotenrüssler, Ceutorhynchus assimilis PAYK.. Mittels einem auf insektizidbeschichteten Glasröhrchen beruhenden Biotestsystem (adult vial tests) wurde die Ausprägung (Stärke und Kreuzresistenzmuster) sowie die geographische Verteilung der Pyrethroidresistenz bei Rapsglanzkäfern und Rapserdflöhen untersucht. Unter Verwendung des identischen Testsystems wurde die Baseline Susceptibility (Ausgangsempfindlichkeit) von Kohlschotenrüsseler gegen lambda-Cyhalothrin erfasst. Unter Verwendung von Thiacloprid, ein Wirkstoff der chemischen Klasse der Neonikotinoide, im Glasröhrchen Testsystem wurde die Baseline Susceptibility vom Rapsglanzkäfer und Kohlschotenrüssler erfasst. Der Metabolismus von Deltamethrin durch native mikrosomale Membranpräparationen des Rapsglanzkäfers wurde untersucht. Die Metabolismusrate von Deltamethrin zu 4-OH-Deltamethrin in vitro war mit der erfassten Pyrethroidresistenz in vivo positiv korreliert und konnte mit PBO inhibiert werden. Mit einer PCR Strategie basierend auf degenerierten Oligonukleotiden wurden Genfragmente der P450 Genfamilie aus Rapsglanzkäfern isoliert und deren Expression mittels qRT-PCR in Populationen mit verschiedenen Resistenzausprägungen quantifiziert. CYP6BQ23 war in resistenten Populationen signifikant hochreguliert. Die Überexpression war signifikant korreliert mit der Resistenzausprägung in vivo und der Umsetzung von Deltamethrin in vitro. CYP6BQ23 wurde in einer Insektenzellkultur rekombinant funktionell exprimiert und der CYP6BQ23 abhängige Deltamethrinmetabolismus bewiesen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass CYP6BQ23 auch tau-Fluvalinat umsetzt. Mithilfe eines Computermodels von CYP6BQ23 wurde die Substratbindung simuliert und eine bessere Bindung für Deltamethrin im Vergleich zu tau-Fluvalinat prognostiziert. Der Einfluss von wirkortspezifischer Resistenz (target-site resistance) wurde ebenfalls untersucht. Vom para-locus, welcher den spannungsabhängigen Natriumkanal im zentralen Nervensystem der Insekten kodiert, wurde ein Genfragment (Domäne IIS4-6) PCR-amplifiziert, sequenziert und auf Einzelnukleotidpolimorphismen (SNPs) untersucht. Ein SNP wurde identifiziert der in einem Aminosäureaustausch von Leucin zu Phenylalanin an Positon 1014 (Musca domestica L. Nummerierung) resultiert. Diese Mutation ist in einer Vielzahl von Insekten als knock down resistance (kdr) beschrieben und vermittelt eine Kreuzresistenz gegenüber Pyrethroiden und DDT. Im Rapserdfloh wurde die gleiche Region im orthologen Locus untersucht mit dem identischen Befund. Die L1014F kdr Mutation im Rapserdfloh ist korreliert mit Bekämpfungsproblemen von Rapserdflöhen beim Einsatz von Pyrethroiden. In den meisten Studien zur Aufklärung von Resistenzmechnismen wurde der Fokus auf eine spezielle Enzym-/Genfamilie gelegt. Um einen holistischeren Weg zu gehen wurde eine Transkriptomstudie beim Rapsglanzkäfer durchgeführt. Ziel war das Assemblieren des de novo Transkriptoms, die Isolierung von Genen die insektizide Wirkorte kodieren und deren Analyse auf SNPs sowie eine komparative Analyse der Genregulierung zwischen pyrethroidresistenten und sensitiven Populationen. Die Konsequenzen der Ergebnisse für ein nachhaltiges Resistenzmanagement in coleopteren Schädlingen in Winterraps and die Möglichkeiten für weiterführende Studien werden diskutiert