Analysis of the specific gene expression of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) in the food matrix

Das Risikolebensmittel Rinderhackfleisch ist als Infektionsquelle für Shiga Toxin-produzierende E. coli (STEC) bekannt. Durch die Aufnahme von unzureichend gegartem Hackfleisch gelangen die pathogenen Bakterien in den Menschen und können zu schweren Krankheiten wie der hämorrhagischen Colitis und dem lebensbedrohlichen hämolytisch-urämischen Syndrom führen. Der E. coli O157:H7 Stamm EDL933 als Vertreter der enterohämorrhagischen E. coli (EHEC), einer Untergruppe der STEC, wurde mit Hilfe der In vivo-Expressionstechnologie auf in vivo-induzierte Gene in Rinderhackfleisch untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Promotor-Selektionsvektor pKK232-8, der auf einer promotorlosen Chloramphenicol-resistenz basiert, kein geeigneter Vektor für die Untersuchung der Genexpression in dieser Matrix war. Eine Detektion von in vivo-exprimierten Genen war unter Verwendung des Alkohol-löslichen und bakteriostatisch-wirkenden Antibiotikums nicht möglich. Durch eine Weiterentwicklung des Systems entstand der Promotor-Selektionsvektor pAK-1. Der Vektor basierte auf einer Wasser-löslichen und bakteriozid-wirkenden Kanamycinresistenz als Selektionsgen. Der Vektor wurde in der vorliegenden Arbeit etabliert und für die Untersuchung der Genexpression in der Matrix Hackfleisch verwendet. Es konnten 20 in vivo-induzierte Gene detektiert werden, die während des Wachstums in Hackfleisch unter erhöhten Temperaturbedingungen bei 42°C exprimiert wurden. Acht Gene besaßen eine Funktion im Kohlenhydrat- und Energiemetabolismus, in der Nukleotidbiosynthese und Makromolekülsynthese, in Transportprozessen und in der Stress-Antwort der Zelle. Dem größeren Anteil von 12 Genen konnte eine putative oder unbekannte Funktion zugeordent werden. Überwiegend konnten die identifzierten Gene nicht mit der Virulenz oder der Stress-Antwort der Zelle in Verbindung gebracht werden. Das Ergebnis des IVET-Systems in dieser Arbeit zeigt, dass mit Hilfe der In vivo-Expressionstechnologie Gene detektiert werden können, die unter spezifischen Bedingungen in der Matrix Rinderhackfleisch exprimiert werden. Ein erster Einblick in die Genexpression des Stammes EDL933 im Rinderhackfleisch konnte gewonnen werden. In weiteren Untersuchungen wurde ein Vergleich der Fitness von 23 E. coli-Isolaten der Serogruppen O26, O103 und O157 durchgeführt. Die Isolate stammten aus Lebens-mitteln, Patienten mit HUS-Erkrankung und Tieren und wurden in der Matrix Rinderhackfleisch verglichen. Die ermittelten Unterschiede waren Stamm- und Temperatur-spezifisch. Die jeweilige Fitness der Stämme variierte abhängig von den gewählten Inkubationstemperaturen von 15°C, 20°C und 37°C. Die Untersuchung der Stämme auf zehn Virulenzfaktoren zeigte, dass die beobachteten Unterschiede in der Fitness nicht auf die Anwesenheit oder die Anzahl der Virulenzfaktoren zurückgeführt werden können. Auch zeigte sich kein Zusammenhang der Fitness mit der Bildung einer Bakterien-hemmenden Substanz.Ground beef as a high risk food is known to be an cause of human infection with Shiga toxin-producing E. coli (STEC). The pathogens infect humans by the ingestion of undercooked ground meat and cause severe diseases like hemorrhagic colitis or the life-threatening hemolytic uremic syndrome. E. coli O157:H7 strain EDL933 as a representative of enterohemorrhagic E. coli (EHEC), a subgroup of STEC, was analysed for in vivo induced genes in ground beef with the help of the in vivo expression technology. It could be demonstrated that the promoter selection vector pKK232-8, which contains a promoterless chloramphenicol resistance gene, is not a suitable vector for a study of gene expression in this matrix. The detection of in vivo expressed genes using the alcohol-soluble and bacteriostatic antibiotic was not possible. Therefore, the promoter selection vector pAK-1 was developed. The new vector system was based on a water-soluble and bactericidal kanamycin resistance gene for selection. In the present study, the vector was established and used for analysis of the gene expression in ground meat. 20 in vivo induced genes that were expressed during growth in ground meat under elevated temperature conditions at 42°C could be detected. Eight genes were associated with energy and nucleotide metabolism, macromolecule synthesis, transport and stress response of the cell. The major part of 12 genes was attributed to a putative or unknown function. Predominantly, identified genes could not be associated with virulence or stress response of the cell. The results of this study, using the in vivo expression technology, showed that genes which are expressed under specific conditions in ground meat could be detected with the help of the chosen method. A first insight into the gene expression of strain EDL933 in ground beef could be acquired. During further investigations a comparison of the fitness of 23 E. coli strains belonging to serogroups O26, O103 and O157 was realized. The isolates originating from foods, patients with HUS and animals were compared in ground beef. The determined differences showed strain-specificity and temperature-specificty. The fitness of the strains varied dependent on the chosen temperatures at 15, 20 and 37 degrees. The analysis of the strains based on ten virulence factors showed that the observed differences could not be attributed to the presence or the number of virulence genes. A correlation between the fitness and the production of a bacteriocin could not be found