Investigations on herbicide resistant grass weeds

Weeds are one of the most troublesome threats for farmers, causing high yield losses and serving as hosts for pathogens and insect pests. Since the introduction of chemical weed control agricultural production systems have changed. During the last years the number of herbicide resistant grass weeds is steadily increasing especially in cereal monocultures. These monocultures are characterised by the repeated use of herbicides with the same modes of action and minimum-tillage practices. All these factors can one by one or all together lead to the development of herbicide resistant grass weeds. In general herbicide resistance is the result of heritable changes to biochemical processes that enable plant survival when treated with herbicides. Two different mechanisms are commonly known to confer resistance: target-site resistance and non-target-site resistance. First is the result of an altered target enzyme, where a single point mutation is changing the amino acid structure and exclude herbicide from effectively binding to the target enzyme. The second one, non-target-site resistance, can be summarised as the mechanisms which includes all other mechanisms than target-site resistance, for example rapid metabolic degradation or translocation of herbicides. In Germany, the most trouble causing weeds associated with target-site resistance are the grass weeds Alopecurus myosuroides Huds. and A. spica-venti L. Beauv.. All investigations carried out during this thesis are dealing with those two weed species. Therefore the main objectives of this thesis are the following: To characterise the resistance levels and patterns of both species. To identify the underlying resistance mechanisms. To develop molecular markers for rapid detection of target-site based resistance. To get an idea of the spatial and temporal distribution of herbicide resistant grass weeds in arable fields. Both investigated species are highly adapted to cereals and developed resistance against ACCase and ALS inhibiting herbicides. So they are an increasing problem for German farmers and in consideration of the fact, that both weeds have developed multiple resistances, detecting and management strategies for controlling and preventing of these weeds are absolutely necessary. Carried out dose response relationships proved strong resistance of the A. myosuroides biotype BR(R) against cycloxydim and fenoxaprop, where low resistance was expressed against clethodim. However, biotype BL(R) showed resistance to fenoxaprop and clodinafop only. Dose response experiments carried out with the A. spica-venti biotype showed resistance to sulfosulfuron and iodo-/mesosulfuron. No cross resistances could be detected in both species. The carried out DNA analysis revealed target-site resistance as the underlying resistance mechanism. BR(R) and BL(R) showed well known substitutions: an amino acid change on position 1781 with in the CT domain result in a change of Leu to Ile which confers resistance to APPs and CHDs in the biotype BR(R). The mutation of Gly to Ala on position 2096 within the CT domain causes resistance to APPs only. Also in the A. spica-venti biotype a amino acid change is the responsible resistance mechanism: a change of Pro to Thr at position 197. These sequencing results serve as basis for the development molecular markers. Designed markers based on dCAPS technology. Such markers were developed to detect SNPs which can cause amino acid changes on the constitutive enzymes. Developed markers can rather differentiate between heterozygous and homozygous resistant alleles. Their technology is based on the fact that restriction endonucleases can cut DNA strands on specific recognition sites. This fact can be used for developing markers which are cutting the DNA in a previously generated PCR fragment on the mutation or wild-type sites, respectively. If there is no recognition site, it can be implemented by specific primers during the PCR. By these markers suspicious samples can be analysed and the results give an advice for management strategies, because target- and non-target-site resistance need different controlling strategies. Investigations on the spatial and temporal distribution of weed populations where carried out on an arable field, invested with herbicide resistant A. myosuroides. Collected and analysed leave samples give information about the spatial dynamics of homozygous, heterozygous and sensitive plants in the field. Results show that the distribution of resistant plants depends on the weed density. Besides the weeds are distributed heterogeneous on the field and occur in patches that are persistent over several years. This example revealed that herbicide resistance is rather associated with crop cultivation measurements. Changes in herbicidal and cultivation measurements shall be practiced to control and to prevent the occurrence of herbicide resistant grass weeds.Unkräuter stellen die wirtschaftlich bedeutendste Gruppe der Schadorganismen dar. Sie verursachen hohe Ertragsverluste und dienen zudem als Wirte für Pathogene und Insekten. Seit Einführung der ersten systemischen Herbizide vollzieht sich ein stetiger Wandel in der Agrarproduktion. Heutzutage ist der Anbau von Agrarprodukten ohne den Einsatz von chemischen Pflanzenschutzmitteln nicht vorstellbar. Aus wirtschaftlichen Gründen hat sich der Pflanzenbau stark gewandelt. Besonders Monokulturen, enge Fruchtfolgen, die wiederholte Anwendung von Herbiziden mit dem gleichen Wirkungsmechanismus und reduzierte Bodenbearbeitung kennzeichnen diese Entwicklung und stellen den Hauptgrund für immer höhere Unkrautdichten dar. Zudem wird immer häufiger über Minderwirkungen von Pflanzenschutzmitteln berichtet. In Europa haben sich vor allem Populationen von Alopecurus myosuroides und Apera spica-venti mit Herbizidresistenzen gegenüber ACCase- und ALS-Inhibitoren selektiert. Da über die beiden Ungrasarten auch in Deutschland zunehmend in Zusammenhang mit Herbizidresistenz berichtet wird, wurden speziell diese Ungräser auf ihre Resistenzentwicklung hin untersucht. Damit ergeben sich für diese Arbeit folgende Aufgabenstellungen: Charakterisierung der Resistenz ausgewählter A. myosuroides und A. spica-venti Biotypen und die Feststellung ihrer Resistenzausprägung gegenüber verschiedenen herbiziden Wirkstoffgruppen Bestimmung der zugrunde liegenden Resistenzmechanismen: Wirkortspezifische oder wirkortunspezifische Resistenz Entwicklung von molekularen Markern zum schnellen und einfachen Nachweis wirkortspezifischer Resistenz und den verursachenden Allelen Anlage und Prüfung eines neuen Versuchsdesigns für Langzeit-Feldversuche zur Untersuchung der zeitlichen und räumlichen Ausbreitung von herbizidresistenten Ungräsern innerhalb einer Praxisfläche. Die Ergebnisse der Untersuchung der Resistenzausprägung bestätigten signifikante Unterschiede der resistenten Biotypen gegenüber den sensitiven Biotypen. Dosis-Wirkungsexperimente zeigten eine eindeutige Resistenz des A. myosuroides Biotyps BR(R) gegenüber FOP und DIM Herbiziden. Die ermittelten Resistenzfaktoren lagen zwischen RF = 8.8 für Clethodim und RF = 130 für Cycloxydim. Der Biotype BL(R) hingegen weist nur eine Resistenz gegenüber den FOP Herbiziden auf. Die für den A. spica-venti ermittelten Resistenzfaktoren lagen bei RF = 83.9 für Sulfosulfuron und bei RF = 10.9 im Fall von Iodo-/Mesosulfuron. Eine Kreuzresistenz gegenüber Herbiziden mit anderen Wirkorten konnte ausgeschlossen werden. Um die zugrunde liegenden Resistenzmechanismen zu ermitteln, wurden DNA Sequenzierungen durchgeführt. Dabei wurde für alle drei Biotypen eine wirkortspezifische Mutation nachgewiesen. Ein Aminosäureaustausch von Leucin zu Isoleucin an Position 1781 wurde im BR(R) Biotyp nachgewiesen. Dieser verursacht eine Resistenz gegenüber FOPs und DIMs. Die nur gegen die FOPs ausgeprägte Resistenz von BL(R) wird durch eine Veränderung von Glycin zu Alanin an Position 2096 verursacht. Beide Aminosäureveränderungen führen also zu unterschiedlichen Resistenzausprägungen. Auch der Resistenz des A. spica-venti Biotyps liegt eine Wirkortveränderung zu Grunde. Ein Austausch der Aminosäuren von Prolin zu Threonin an Position 197 des für die ALS kodieren Gens ist die Ursache dieser Resistenz. Dies konnte durch einen ALS-Enzym-Assay der sensitiven und resistenten Biotypen belegt werden, bei dem die Enzymaktivität durch den ALS-Wirkstoff im resistenten Biotype deutlich weniger beeinflusst wird. Auf den Sequenzierergebnissen beruhend wurden molekulare Marker anhand der dCAPS Methode entwickelt. Im Gegensatz zur DNA Sequenzierung, ist diese Methode sehr schnell und kostengünstig, zudem lassen sich auch heterozygote Resistenzen eindeutig nachweisen. Um die Populationsdynamik von Biotypen mit einer wirkortspezifischen Resistenz zu untersuchen, wurde eine Praxisfläche mit einem natürlichen Vorkommen einer resistenten Ackerfuchsschwanzpopulation beobachtet. Die Ergebnisse zeigten eine Persistenz der Ungrasnester über den untersuchten Zeitraum. Die Unkrautdichte, hing von den angebauten Kulturpflanzen und dem Ungrasmanagement ab. Die Analyse und Darstellung der Genotypen gesammelter Einzelpflanzen zeigte eine positive Korrelation zwischen der Unkrautdichte und dem Anteil an resistenten Ackerfuchsschwanzpflanzen. Die erzielten Ergebnisse sollen einem besseren Verständnis der Einflußfaktoren auf die Entstehung von Herbizidresistenzen bei Ungräser dienen und somit zukünftige Managementmaßnahmen unterstützen