Impact of glyphosate application to transgenic Roundup Ready® soybean on horizontal gene transfer of the EPSPS gene to Bradyrhizobium japonicum and on the root-associated bacterial community

Abstract In this study, two topics causing major public concern related to transgenic plants were investigated: The possibility of a horizontal gene transfer from plant to bacteria and the impact of transgenic plants after herbicide treatment on root associated bacteria. The transgenic plant chosen for this study was Roundup Ready® (RR) soybean, which is tolerant to the herbicide glyphosate and is the most commonly used genetically modified crop worldwide. Glyphosate, the active ingredient of Roundup Ready®, inhibits the EPSPS enzyme (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase). EPSPS is an enzyme involved in the shikimic acid pathway leading to the aromatic amino acid biosynthesis and its inhibition leads to growth reduction of plants and microorganisms. RR crops are glyphosate tolerant due to the introduction of the CP4-EPSPS gene coding for a glyphosate insensitive EPSPS enzyme. The transgenic construct is under expression of a CaMV 35S promoter a nos transcriptional termination element from Agrobacterium tumefaciens. Horizontal gene transfer experiments with the EPSPS gene of the RR soybean were performed under controlled laboratory conditions and were targeted to the nitrogen fixing symbiont of soybean Bradyrhizobium japonicum. This bacterium comprises the requirements of a possible receptor for the glyphosate resistance trait, as it is sensitive to the herbicide and thus the acquirement of glyphosate resistance would signify a positive adaptation to glyphosate accumulated in the roots after herbicide application. Two key conditions for gene transfer from the CP4-EPSPS gene from the RR soybean to B. japonicum were evaluated in this study: The required specific conditions for B. japonicum to undergo natural transformation and the expression of the CP4-EPSPS gene in B. japonicum. For that purpose, the CP4-EPSPS gene was cloned into a B. japonicum chromosomal integration vector and was transferred by biparental mating into the B. japonicum genome. Subsequently, the expression of the CP4-EPSPS gene in B. japonicum was tested under increasing glyphosate selection pressure. Results of these experiments indicated that B. japonicum is not naturally transformable under any conditions known from the more than 40 so far reported naturally transformable bacteria. Furthermore, the CP4-EPSPS genetic construct, as contained in RR soybean, has been shown in this study to be not active in B. japonicum. Consequently, if there would be a gene transfer of the plant CP4-EPSPS to B. japonicum, this genetic construct does not confer glyphosate resistance to B. japonicum and does not constitute any adaptive advantage to the bacterium under glyphosate selection pressure. As the genetic trait of glyphosate resistance has been found in several bacteria, it would be more probable that the common mating exchange between bacterial groups could disperse the glyphosate resistance within an environment. Moreover, in the specific case of B. japonicum, a high spontaneous mutation rate for glyphosate resistance was observed, suggesting that B. japonicum can also adapt to the glyphosate selection pressure by mutation under natural conditions. The impact of transgenic plants with their respective herbicide treatments on root associated bacteria was investigated in a greenhouse experiment. The composition and diversity of bacterial communities of RR soybean rhizospheres were analyzed and compared between glyphosate-treated and untreated plants. Samples from five harvests with two glyphosate applications were analysed by 16S rRNA gene T-RFLP analysis complemented with the evaluation of three clone libraries. Multivariate statistical analysis of the data was used to visualize changes in the microbial populations in response to glyphosate applications and in order to find groups of organisms responsible for the observed community shifts. A comparison of the rhizosphere communities revealed that a Burkholderia related group was significantly inhibited by glyphosate application, while the abundance of a group of Gemmatimonadetes related sequences increased significantly after the herbicide treatment. The significant increment of Gemmatimonadetes abundance after glyphosate application could indicate that these organisms are able to metabolize the herbicide. Shannon diversity indices were calculated based on the T-RFLP results with the aim to compare bacterial diversity in the rhizosphere of glyphosate-treated and non treated RR soybeans. Interestingly, the bacterial community associated to RR soybean roots after glyphosate application not only demonstrated effective resilience after the disturbance but in addition the bacterial diversity also increased in comparison to the untreated control samples. It is possible, that in an environment with organisms which are able to metabolize glyphosate, the key for enhancing diversity could be the succession of metabolites, which can be further utilized by a diverse range of bacteria.Zusammenfassung In dieser Arbeit wurden zwei Fragestellungen bezüglich transgener Pflanzen, die von erheblichem öffentlichen Interesse sind, bearbeitet: Die Möglichkeit eines Gentransfers von diesen Pflanzen zu Bodenbakterien, sowie der Einfluss transgener Pflanzen in Kombination mit Herbizidapplikationen auf die bakterielle Gemeinschaft der Rhizosphäre. Als Versuchspflanze wurde eine transgene Roundup Ready® (RR) Sojabohne verwendet, welche tolerant gegenüber dem Herbizid Glyphosat ist. Diese Pflanze ist die weltweit am häufigsten angebaute genetisch veränderte Pflanze. Glyphosat, der aktive Wirkstoff von Roundup Ready®, inhibiert das Enzym EPSPS (5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphate Synthase). EPSPS ist ein Enzym des Shikimatweges, der für die Bildung aromatischer Aminosäuren verantwortlich ist. Die Inhibierung dieses Enzyms führt zu einer Verringerung des Wachstums von Pflanzen und Mikroorganismen. Durch die Anwesenheit eines Glyphosate-toleranten EPSPS-Enzymes sind RR-Pflanzen gegenüber Glyphosat tolerant. RR Pflanzenlinien beinhalten das CP4-EPSPS-Gen, welches ursprünglich aus Agrobacterium sp. CP4 stammt, jedoch den CaMV 35S Promotor sowie den Nos Terminator enthält. Experimente über die Möglichkeit eines horizontalen Gentransfers des EPSPS Gens von RR Soja wurden unter kontrollierten Laborbedingungen durchgeführt. Das stickstofffixierende, symbiontische Bakterium, Bradyrhizobium japonicum, erfüllt wichtige Voraussetzungen eines möglichen Empfängers der Glyphosatresistenz, da es sensitiv gegenüber dem Herbizid ist und somit die Erlangung einer Glyphosatresistenz eine positive Anpassung an erhöhte toxische Mengen des Wirkstoffes in den Wurzeln nach Herbizidapplikation darstellt. Zwei wichtige Bedingungen für den Gentransfer des CP4-EPSPS Gens von RR Soja zu B. japonicum wurden in dieser Arbeit überprüft: Die von B. japonicum benötigten spezifischen Bedingungen für die Erlangung einer natürlichen Transformierbarkeit und die Expression des CP4-EPSPS Gens in B. japonicum. Ergebnisse dieser Experimente belegen, dass unter den bekannten Bedingungen für natürliche Transformation B. japonicum nicht transformierbar ist. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass B. japonicum unter bisher unbekannten Bedingungen mit CP4-EPSPS transformiert werden könnte. Des Weiteren wurde untersucht, ob ein CP4-EPSPS Gen integriert in das Genom von B. japonicum von diesem Bakterium exprimiert wird und dadurch zu einer Glyphosattoleranz führen kann. Für diesen Zweck wurde CP4-EPSPS in einen chromosomalen Integrationsvektor für B. japonicum kloniert und durch biparental mating in das B. japonicum Genom transferiert. Anschließend wurde die Expression des Gens in B. japonicum unter ansteigendem Selektionsdruck durch Glyphosat getestet. Es konnte jedoch keine erhöhte Glyphosate Resistenz bei Anwesenheit dieses Genkonstruktes aus RR Soja in B. japonicum festgestellt werden. Folglich würde ein möglicher Gentransfer des pflanzlichen CP4-EPSPS zu B. japonicum zu keiner Glyphosatresistenz führen und somit keinen Anpassungsvorteil für das Bakterium unter Glyphosatselektionsdruck darstellen. Eine Übertragung der genetischen Eigenschaft der Glyphosatresistenz, welche in mehreren Bakterien gefunden wurde, würde sich daher wahrscheinlich eher durch herkömmliches Maiting zwischen den Bakteriengruppen in der Umwelt verbreiten, als durch eine Übertragung von Pflanze zu Bakterium. Die Auswirkung der Anpflanzung von RR Soja mit Glyphosatbehandlung auf die wurzelassoziierten Bakterien wurde in einem Gewächshausversuch untersucht. Die Zusammensetzung und Diversität der bakteriellen Gemeinschaft der Rhizosphäre von RR Soja wurde analysiert und zwischen Glyphosat behandelten und unbehandelten Pflanzen verglichen. Proben von fünf Zeitpunkten und zwei Glyphosatapplikationen wurden mittels 16S rRNA Gen T-RFLP Methode analysiert und ergänzt durch die Erstellung und Auswertung dreier Klonbanken. Multivariate statistische Datenanalysen wurden verwendet, um Veränderungen der bakteriellen Populationen durch die Glyphosatbehandlung zu visualisieren und um Indikatorgruppen von Organismen zu identifizieren, die von diesen Veränderungen betroffen sind. Die Analysen zeigten, dass eine Burkholderia-ähnliche Gruppe signifikant durch Glyphosatapplikation inhibiert wurde, während die Häufigkeit Gemmatimonadetes verwandter Sequenzen signifikant nach Herbizidanwendung anstieg. Der signifikante Anstieg dieser Gruppe könnte andeuten, dass diese Bakterien fähig sind das Herbizid zu metabolisieren. Shannon Diversitätsindizes wurden anhand der T-RFLP Profile berechnet, mit dem Ziel, die Diversität der bakteriellen Rhizosphärengemeinschaften zwischen Glyphosat behandelten und unbehandelten RR Sojabohnen zu vergleichen. Interessanterweise zeigte die bakterielle Gemeinschaft der RR Sojarhizosphäre nach Glyphosatapplikation nicht nur eine effektive Resilienz nach der Störung, sondern es konnte sogar eine Erhöhung der Diversität im Vergleich zu unbehandelten Proben festgestellt werden. Folglich ist es möglich, dass diverse Bakterien, die fähig sind über eine Suksession von Metaboliten des Glyphosates abzubauen, zur Erhöhung der Diversität der bakteriellen Gemeinschaft beitragen