Effects of combination therapy of PDE5 inhibitor sildenafil and multikinase inhibitors sorafenib and sunitinib in NSCLC

Lung cancer is still the leading cause of death amongst the various types of cancers. This study researched the influence of a combined therapy, consisting of a multi-kinase inhibitor and a specific phosphodiesterase 5 inhibitor, compared with that of a single inhibitor used in mono-therapies and compared with that in a placebo. On the day the experiment commenced, all the animals received a subcutaneous injection of isolated A549 cells just above the muscle of the right buttock. Each of the seven animal test groups consisted of 6-10 laboratory animals (nude mice). For the duration of the experiment of 28 days, the animals were treated with different inhibitors in the form of oral medication: sildenafil, a specific PDE5 inhibitor, sorafenib and sunitinib as multi-kinase inhibitors, the combined therapy groups sorafinib + sildenafil and sunitinib + sildenafil, the placebo groups (these laboratory animals received an oral dose of methylcellulose), and finally the control group – there was no intervention with these animals. The animals received the same dosage of medication. The size of the tumor was measured every four days. The largest increase in volume occurred, as expected, in the control and the placebo groups. The smallest increase in volume occurred in the combined-therapy groups. The most constant was, however, for the combination of sunitinib + sildenafil. The mRNA expression of individual growth factor receptors from tissues of the control group was examined with the help of real-time PCR. In order to capture the influence of tumor stroma, the following were also examined: human fibroblasts, monocytes, macrophages, lymphocytes, donor lung tissue, and, for comparison, isolated and cultivated A549 cells. The receptors cKIT, RET, CSF-1R, Flt3, PDGF-alpha, PDGF-beta, EGF, VEGF3 and also the receptor for PDE5a showed an expression in every sample examined. Flt.1 and KDR showed no expression in isolated A549 cells; however, they did show expressions in the rest of the tissues. Furthermore, some of these factors were compared among themselves and examined for their expression in the tumors of the individual groups by means of immunohistochemical quantification. At the end of the experiment, the resulting tumor was dissected from the attached tissue and, after the usual preparation, cut for the immunohistochemical examination. We could demonstrate a decrease in the expression of the various growth factor receptors that were inhibited. In particular, PDGFR-beta, Flt-1 and EGFR showed a significant decline in the density of receptors. Additionally, the active rate of cell division (PCNA) and the existing section of the vessels were stained and compared with one another. It was interesting to note, that the one with the smallest increase in tumor volume had the largest number of vessel sections and a slightly higher active rate of cell division, in comparison to the mono-therapy group. The combined therapy of a multi-kinase inhibitor and the specific PDE5 inhibitor appears to be a good therapy option for NSCLC, as the tumor growth is delayed and so the chance of survival increased. The influence of the factors studied provided no detailed information about the mode of action effective in this kind of therapy, in particular with regards to angiogenesis. This needs to be examined in further studies.Lungenkrebs ist noch immer die weltweit führende Krebserkrankung mit Todesfolge. Diese Studie untersuchte den Einfluss einer Kombinationstherapie, bestehend aus einem Multikinaseinhibitor und einem spezifischen Phosphodiesterase-5-Inhibitor im Vergleich mit den einzelnen Inhibitoren als Monotherapiegabe und im Vergleich zu einer Placebogabe bzw. einer Versuchsgruppe ohne Intervention. Am Tag des Versuchsbeginns wurde allen Tieren isolierte A549 Zellen subkutan oberhalb des Muskels am rechten Hinterlauf injiziert. Die sieben Versuchstiergruppen bestanden aus den jeweils 6-10 Versuchstieren (Nacktmäuse) und wurden während der Versuchsdauer von 28 Tagen mit den unterschiedlichen Inhibitoren als orale Medikation behandelt. Die Behandlungen erfolgten mit Sildenafil, als spezifischer PDE5-Inhibitor, Sorafenib und Sunitinib als Multikinaseinhibitoren, die Kombinationentherapiegruppen bestehend aus Sorafenib + Sildenafil und Sunitinib + Sildenafil, des Weiteren die Placebogruppe. Diese Versuchstiere bekamen Methylcellulose oral verabreicht und zuletzt die Kontrollgruppe, an der keine Intervention stattgefunden hat. Die Tiere erhielten jeden Tag die gleiche Medikamentendosis, jeden 4. Tag erfolgte eine Messung der Tumorgröße. Die größte Volumenzunahme zeigte sich, wie zu erwarten war, bei der Kontroll- und bei der Placebogruppe, die kleinste Volumenzunahme zeigte sich bei den beiden Kombinationstherapiegruppen, am konstantesten jedoch bei der Kombination aus Sunitinib + Sildenafil. An Tumorgewebe aus der Kontrollgruppe wurde die mRNA-Expression einzelner Wachstumsfaktorenrezeptoren untersucht. Um den Einfluss des Tumorstroma zusätzlich zu erfassen, wurden humane Fibroblasten, Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten und humanes Donorlungengewebe und zum Vergleich isolierte und angezüchtete A549-Zellen untersucht. Die Rezeptoren cKIT, RET, CSF-1R, Flt3, PDGF-alpha, PDGF-beta, EGF, VEGF3 sowie der PDE5a-Rezeptor waren in allen untersuchten Proben exprimiert, Flt-1 und KDR zeigten keine Expression in isolierten A549-Zellen, jedoch in den übrigen Gewebearten. Weiter wurden einige dieser Faktoren mit Hilfe immunhistochemischer Quantifikation auf ihre Expression in den Tumoren der einzelnen Gruppen untersucht und untereinander verglichen. Nach Versuchsende wurden dafür die entstandenen Tumore von dem darunterliegenden Gewebe abpräpariert und nach üblicher Vorbereitung für die Immunhistochemie aufgeschnitten. Es zeigte sich eine Abnahme der Expression von diversen Wachstumfaktorrezeptoren unter Inhibition. Vor allem PDGFR-beta, Flt-1 und EGFR zeigten eine signifikante Abnahme der Rezeptorendichte. Desweiteren wurden die aktive Zellteilungsrate (PCNA) und die vorhandenen Gefäßanschnitte (vWF+alpha actin) angefärbt und untereinander verglichen. Interessanterweise zeigte sich bei der geringsten Volumenvergrößerung des Tumors die größte Anzahl von Gefäßanschnitten und eine etwas höhere aktive Zellteilungsrate im Vergleich zu den Monotherapiegruppen. Die Kombinationstherapie aus einem Multikinaseinhibitor und dem spezifischen PDE5-Inhibitor scheint eine gute Therapieoption für NSCLC zu sein, da das Tumorwachstum verzögert wird und damit die Überlebenswahrscheinlichkeit steigt. Der Einfluss auf die untersuchten Faktoren konnte jedoch keinen sicheren Aufschluss über den genauen Wirkmechanismus dieser Therapie geben, besonders in Hinblick auf die Angiogenese. Dies sollte in weiterführenden Studien näher untersucht werden