Suitability of in vitro, in silico and in vivo methods to predict intestinal absorption in drug development

As oral administration of pharmaceutical drugs in patients is the preferred route, special interest is given to predict the ability of a new compound to be absorbed in man. During the last 60 years, a vast number of in vitro, in vivo and in silico absorption models have been developed in order to estimate human intestinal permeability and eventually the fraction of dose absorbed of a compound administered. These were comprehensively characterised and discussed with regards to their strengths and limitations in this thesis. Depending on the stage of the pharmaceutical development process different models can be suitable. Furthermore, two common absorption models were challenged on their ability to investigate the extent of drug absorption. Firstly, the in vitro Ussing chamber technique using rat jejunal tissue was experimentally established and successfully validated using the reference compounds 14C-mannitol, 3H terbutaline, 3H-propranolol, 3H-verapamil and 14C fexofenadine. Bidirectional permeability studies were conducted, determining the apparent permeability (Papp) of the compounds and the ability to display absorption mechanisms was investigated. Furthermore, reasons for variability found when comparing several reported permeability values in literature was examined, focusing on studying non-specific binding (NSB) of the compound to the experimental equipment. Also, the influence of two tissue preparation techniques (“stripped” or full-thickness tissue) was investigated. Results from the Ussing chamber experiments revealed that NSB can have a crucial influence on the Papp especially for lipophilic compounds. The tissue preparation technique showed a greater influence on the transcellularly absorbed compounds rather than the paracelullarly permeating ones. The route of absorption for each compound could be identified, showing paracellular absorption for mannitol and terbutaline, transcellular absorption for propranolol and verapamil and active uptake of fexofenadine. To ensure comparable results for all compounds, determination of NSB prior to permeability experiments should be mandatory and “stripping” of the rat jejunum is recommended. Secondly, the in silico physiologically based absorption software GastroPlus™ was challenged, on the ability to predict fraction absorbed (fa) and the absorption rate constant (ka) for eight compounds under development at Bayer Pharma AG, in a retrospective analysis with preclinical and clinical data, using the basic default settings of the software. The influence of the input parameters (physicochemical, physiological and formulation properties) were investigated via parameter sensitivity analysis and predictability for different species was compared. Results from GastroPlus™ simulations showed good predictability of fa with 77 % within a 2 fold error. The tendential overprediction of fa for the species dog, suggested lowering the species-specific Peff converting factor from 3.3 to about 2. The parameter sensitivity analysis for one compound (C5) suggested that an increase of stomach pH in the dog from 3.0 to 4.3 could lead to a distinct decrease (by 64 %) in fraction absorbed. Adjusting the stomach pH prior to in vivo pharmacokinetic studies in the dogs should be considered for compounds with pH-dependent solubility to reduce variability. The general underprediction of ka for simulations with a fast absorption phase in vivo, recommends improvement of the solubility input data. The parameters permeability and solubility were identified as critical input properties. It was suggested, to use the Ussing chamber absorption model to generate a reliable permeability input parameter (Peff). Furthermore, the use of biorelevant buffer systems that mimic the in vivo situation should be used for solubility tests to improve predictability of the in silico tool.Die orale Administration ist die präferierte Applikationsroute für die Versorgung von Patienten mit pharmazeutischen Arzneimitteln. In der Arzneimittelentwicklung ist es von großem Interesse die intestinale Absorption von neuen Entwicklungssubstanzen im Menschen vorherzusagen. Während der vergangenen 60 Jahre wurden zahlreiche in vitro, in vivo und in silico Absorptionsmodelle entwickelt um die intestinal Absorption im Menschen abzuschätzen und die absorbierte Fraktion der Dosis im Menschen vorherzusagen. Die wichtigsten Absorptionsmodelle wurden ausführlich in dieser Dissertation charakterisiert und evaluiert und ihre Stärken und Limitationen diskutiert. Die Eignung der einzelnen Absorptionsmodelle ist stark abhängig von der Fragestellung und dem Zeitpunkt der Untersuchungen in der Arzneimittelentwicklung. Desweitern wurden zwei Absorptionsmodelle genauer untersucht um ihre Vorhersagbarkeit der intestinalen Absorption zu bewerten. Zunächst wurde die Ussingkammer Methode unter Einsatz von Rattenjejunum experimentell etabliert und unter Verwendung von bekannten Referenzsubstanzen für die Bestimmung der apparenten Permeabilität (Papp) in bidirektionalen Permeabilitätsexperimenten erfolgreich validiert. Die unterschiedlichen Absorptionsmechanismen der Referenzsubstanzen konnten klar dargestellt werden. Zwei wichtige Einflüsse auf die Permeabilitätsexperimente wurden identifiziert: Zum einen die unspezifische Bindung an das Ussigkammer Material und die Präparationstechnik des Darmgewebes. Die unspezifische Bindung (NSB) kann im Falle von lipophilen Substanzen erheblich sein und sollte vor dem Durchführen von Permeabilitätsexperimenten für jede Substanz bestimmt werden. Dieser Wert kann dann als Korrekturfaktor für die Berechnung er Permeabilität mit einfließen. Desweitern ist es speziell für transzellulär absorbierte Substanzen empfehlenswert das Jejunum zu „strippen“ d.h. von zusätzliche Gewebeschichten wie der Tunica serosa zu befreien. Als zweites Absorptionsmodell wurde das Physiologie-basierte in silico Absorptionsmodel GastroPlus™ in einer retrospektiven Analyse eingesetzt, um die intestinale Absorption für acht Entwicklungssubstanzen der Bayer Pharma AG vorherzusagen. Die Parameter, absorbierte Fraktion der Dosis (fa) und Resorptionsgeschwindigkeitskonstante (ka), wurden zur Beurteilung der Vorhersagbarkeit genutzt. Die mit den Standardeinstellungen vorhergesagten Parameter wurden anschließend mit den in vivo Parametern aus den präklinischen und klinischen Studien verglichen. Wichtige Faktoren die fa und ka beeinflussen, wurden mittels Parametersensitivitätsanalyse untersucht. Die Vorhersagbarkeit für fa war gut mit 77 % innerhalb der vorgegebenen Akzeptanzkriterien (d.h. zweifache Abweichung vom in vivo Wert). Es gab eine tendenzielle Überschätzung für die Spezies Hund, die suggeriert, dass der Spezieskonvertierungsfaktor abgepasst werden sollte. Die Parametersensitivitätsanalyse für Substanz C5 zeigte eine starke Abnahme der absorbierte Fraktion um 64 %, wenn der Magen pH von 3.0 auf 4.3 steigt. Eine einfache Methode um solche Einflussgrößen zu reduzieren ist z.B. die Vorbehandlung der Hunde vor der Administration der oralen Formulierung in PK Studien um den Magen pH zu stabilisieren. Der Parameter ka wurde für Substanzen mit einer niedrigen in vivo Absorptionsrate vornehmlich unterschätzt. Die Einflussgrößen Permeabilität und Löslichkeit wurden als sensitive Parameter identifiziert. Die Nutzung von biorelevante Medien zur Bestimmung der Löslichkeit, und mit der Ussingkammer Methode generierten Permeabilitätswerte, könnten besseres Inputparametern bieten, die die Vorhersagbarkeit der in silico Methode verbessern könnte