Antiviral therapy of chronic hepatitis B : identification of new resistance mutations and optimization of therapy monitoring

Das Hepatitis-B-Virus (HBV) verursacht eine der häufigsten Viruserkrankungen weltweit. Unbehandelt führt die aktive chronische Hepatitis B fast immer zu ernsten Leberschädigungen, wie Leberfibrose oder -Zirrhose, mit fatalen Folgen, wie dem hepatozellulären Karzinom. In dieser Arbeit wurde ein zuvor beschriebenes HBV-Isolat (150-1) aus einem Patienten mit chronischer Hepatitis B weiter analysiert, das gegen die Nukleotidanaloga Adefovir und Tenofovir auffällig hohe Resistenzen in vitro zeigte. Bei diesem Isolat 150-1 konnte in dieser Arbeit in der Primerdomäne der HBV-Polymerase die Mutation prT76S ermittelt werden, die als Sekundärmutation zusammen mit den Primärmutationen in der Reversen Transkriptase (rtA181V und rtN236T) für die auffällig hohe Resistenz des Klons gegen Tenofovir und Adefovir verantwortlich ist. Hierbei wurde erstmalig eine Resistenzmutation gegen NA beschrieben, die sich in der Primer-Domäne der viralen Polymerase und damit außerhalb der Reversen Transkriptase befindet. Unabhängig davon wurden in zwei Studien in Zusammenarbeit mit der AG Roggendorf, Universitätsklinikum Essen, Therapieverläufe chronisch WHV-infizierter Woodchucks als Surrrogat-Tiermodel für die Hepatitis B des Menschen untersucht. Diese wurden in einer ersten Studie mit Entecavir und einer DNA-(„prime-boost“)-Vakzinierung zur Stimulation von T-Zellen gegen T-Zell-Epitope des WHsAg und WHcAg therapiert. In der zweiten Studie wurden zusätzlich zu der Behandlung mit Entecavir und der DNA-Vakzinierung, spezifische Antikörper gegen den Liganden (PD-L1) eines „Selbstmord“-Rezeptors (PD-1-Rezeptor) auf T-Zellen verabreicht, die einen Verlust („Erschöpfung“) der relevanten T-Zell-Population verhindern sollten. In dieser Arbeit wurde der Therapieerfolg, vergleichbar zur HBV-Therapie, anhand der WHsAg-Konzentration im Blut der Woodchucks mittels Laurell-Elektrophorese ermittelt. Die spezifische antivirale Immunreaktion bei den infizierten Woodchucks konnte durch die oben genannten Behandlungen stimuliert werden und führte bei einigen Tieren zu einem völligen Verschwinden des WHsAg auch nach Beendigung der Therapie. Unter Einbeziehung weiterer klinischer Parameter kann in diesen Fällen von einer Heilung der chronischen Hepatitis B im Tiermodell bei Woodchucks ausgegangen werden. Diesen Untersuchungen unterstreichen die Bedeutung der HBsAg-Bestimmung für die TherapieÜberwachung der chronischen Hepatitis. Daher wurden stabile, eukaryote Zelllinien zur HBsAg-Produktion des WHO-Genotypen-Panels hergestellt, wodurch es nun möglich ist in vitro rekombinantes HBsAg in nahezu unlimitierten Mengen zu exprimieren, das nachweislich im eigenen HBsAg-Testsystem, wie auch mit einem kommerziellen diagnostischen Test, wie dem qHBsAg-Test im System „Architect“, (Abbott), reagierte. Mit diesem Panel können die Limitationen des WHO-Serum-Panels (limitierte Verfügbarbeit, Infektiosität, Heterogenität von humanen Serum-Proben) verbessert werden und neu auftretende, schlecht nachweisbare HBV-Varianten schneller integriert werden.The hepatitis B virus (HBV) causes one of the most common virus diseases worldwide. An untreated active chronic hepatitis B often leads to liver fibrosis or cirrhosis with fatal consequences, e.g. development of hepatocellular carcinoma (HCC). The goal of this thesis was to further analyze the previously described cloned HBV isolate 150-1 from a patient with chronic hepatitis B that shows noticeable high resistances against the nucleotide analogues Adefovir and Tenofovir in vitro. In this thesis it could be shown that the mutation prT76S in the primer domain of the HBV polymerase of the isolate 150-1 works as a secondary mutation together with the primary mutations within the reverse transcriptase (rtA181V and rtN236T) and is responsible for the extraordinary resistance of this clone against Tenofovir and Adefovir. Thereby for the first time a resistance mutation against NA was described that lies in the primer domain of the viral polymerase and therefore outside the reverse transcriptase. Besides that, two studies were performed together with the AG Roggendorf, University Medical Center Essen, to investigate experimental therapies in woodchucks chronically infected with the related woodchuck hepatitis virus (WHV) as a surrogate model for human hepatitis B. In the first study the woodchucks were treated with the NA Entecavir and a DNA- (prime-boost) vaccination for the stimulation of T cells against T cell epitopes of the WHV surface (WHsAg) and core (WHcAg) antigen. In the second study additionally to the treatment with Entecavir and the DNA vaccination specific antibodies against the ligand (PDL1) of a ´suicidal receptor (PD-1-Receptor) on T cells were given that should prevent the exhaustion of the relevant T cell population. In this thesis, success of therapy was determined by quantification of the surface antigen concentration in the blood, comparable to HBV therapy using Laurell electrophoresis. Specific antiviral immune reaction in the infected woodchucks could be stimulated by the above-named treatment with total disappearance of the WHsAg in some animals even after stop of treatment. With the inclusion of further clinical parameters, healing of chronic hepatitis B in the woodchuck model could be achieved, at least in some cases. These results underline importance of HBsAg determination for therapy control of chronic hepatitis B. Thus, the establishment of stable eukaryotic cell lines for HBsAg expression of the WHO HBV genotype panel allows production of recombinant SHBs in vitro in nearly unlimited amounts, which reacted similarly in “in-house tests” and commercial quantitative diagnostic tests for HBsAg (Abbott Architect). With this panel the limitations of the WHO serum panel (like limited availability, infectivity, heterogeneity of human plasma samples) could be improved and adapted to emerging HBV variants in the future