Characterization of the phenotypic resistance of hepatitis B virus mutants to anti-viral nucleoside and nucleotide analogues

Zurzeit sind etwa 240 Mio. Menschen auf der Welt chronisch mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) infiziert. Im Gegensatz zu einer akuten Infektion sollte die chronische Hepatitis B therapiert werden, um das Risiko von oft fatalen Folgeerkrankungen zu minimieren. Die Therapie mit Interferon alpha ist nur bei einem Teil der Patienten erfolgreich. Daher bleibt vielen Patienten nur eine Therapie mit Inhibitoren der viralen Reversen Transkriptase. Diese muss jedoch meist lebenslang erfolgen, da die ungewöhnlich hohe Variabilität dieses DNA-Virus eine Resistenzbildung begünstigt. Deshalb ist eine optimale und individualisierte Therapie von großer Bedeutung. Mithilfe genotypischer Analysen der HBV-Genome können bereits bekannte virale Resistenzmutationen identifiziert und so die antivirale Behandlung angepasst werden. Aber nur mit einer phänotypischen Charakterisierung können neue, bislang unbekannte HBV-Varianten eindeutig identifiziert und mit einer Resistenz verknüpft werden. Der bereits in der Arbeitsgruppe von PD Dr. D. Glebe am Institut für Medizinische Virologie der Universität Gießen etablierte phänotypische Assay zur viralen Resistenzbestimmung des HBV wurde weiter optimiert, um auch für HBV-Mutanten mit sehr geringer Replikation noch verlässlichere und genauere Resistenzdaten ermitteln zu können. Die Verlässlichkeit des verwendeten Assays konnte in einer Ringstudie mit einer ebenfalls am Projekt beteiligten Arbeitsgruppe bestätigt werden. Außerdem wurde eine neue Methode für den Replikationsnachweis von 1.5-fachen Überlängenkonstrukten entwickelt. Zumindest HBV-Isolate mit einer ausreichend starken Replikation können daher jetzt auch unter der vollständigen Kontrolle ihres natürlichen Promotors phänotypisch charakterisiert werden. Im Rahmen eines vom BMBF-geförderten Projekts zur Molekularen Diagnostik (HOPE-Projekt) wurden in dieser Arbeit 26 HBV-Isolate aus chronisch infizierten Patienten auf ihre Resistenz gegen die vier bedeutendsten antiviralen Medikamente (Lamivudin, Adefovir, Entecavir und Tenofovir) getestet. Ein Großteil der Ergebnisse bestätigte die bisherigen Erkenntnisse über die Resistenzentwicklung. Einige Phänotypen konnten jedoch anhand der bekannten Resistenzmutationen nicht erklärt werden. So wurde eine Kreuzresistenz auf Grundlage der Lamivudin-Resistenzmutationen rtM204I/V gegen Adefovir und Tenofovir detektiert, die außerhalb des HOPE-Projekts bisher nicht beschrieben wurde. Außerdem wurde ein vermindertes Ansprechen auf hohe Entecavirkonzentrationen im phänotypischen Assay festgestellt. Die außergewöhnlich hohe Adefovir- und Tenofovirresistenz des bereits zuvor charakterisierten multiresistenten Isolats FvB 150 1 war allein mit den bekannten Mutationen rtA181T und rtN236T nicht zu erklären. Es konnte gezeigt werden, dass neben diesen beiden Mutationen der Austausch T76S in der Primerdomäne für die hohen Resistenzen verantwortlich ist. Damit wurde erstmals ein Aminosäureaustausch außerhalb der Reversen Transkriptase der HBV-Polymerase als Resistenzmutation identifiziert. Unabhängig davon wurden weitere virale Varianten getestet, die in einer kürzlich publizierten Studie beschrieben wurden. Sie wurden gehäuft in Patienten, die während der Therapie einen virologischen Durchbruch der HBV-Infektion erlitten hatten, gefunden und standen daher im Verdacht einen Einfluss auf die Resistenzentwicklung zu haben. Die ermittelten phänotypischen Daten zeigten jedoch, dass es sich bei den Austauschen rtS78T, rtL229F/V und rtM309K wahrscheinlich nicht um Resistenzmutationen handelte.Currently, about 240 million people in the world are chronically infected with the hepatitis B virus. An acute infection does not require a specific therapy, whereas the chronic Hepatitis B has to be treated to minimize the risk of a secondary disease like cirrhosis of the liver and hepatocellular carcinoma. The therapy with interferon alpha is by far not in all cases successful. Therefore, for many patients remain only an inevitable life-long treatment with reverse transcriptase inhibitors. In addition, the high variability of the virus favors the development of resistance. Hence an optimal adapted therapy is very important. Genotypic analyzes can only identify already known resistance mutations. But the clear link of a new mutation to resistance is only possible with the results of a phenotypic characterization The already in the group of PD Dr. D. Glebe at the Institute of Medical Virology of the University of Giessen established phenotypic assay for resistance testing was further optimized in order to obtain more reliable and accurate resistance data even with HBV-mutants with very low viral replication. The reliability of the assay was confirmed in a collaborative study with a working group, which is also involved in the project. In addition, a new PCR-based method for the quantification of the viral replication of 1.5-fold HBV over length constructs was developed. With this qPCR at least HBV isolates with a sufficiently strong replication can be characterized under the full control of its natural promoter to analyze its effect of the replication strength. In the context of the BMBF-funded HOPE-project 26 isolates from chronic infected patients were tested for their resistance to the four major antiviral drugs (lamivudine, adefovir, entecavir and tenofovir). The majority of the results confirmed the previous findings on the development of resistance. However, some phenotypes could not be explained based on the known resistance mutations. Thus, cross-resistance was detected on the basis of lamivudine resistance mutations rtM204I/V to adefovir and tenofovir and the phenotypic data showed a reduced response on high entecavir concentrations, which both have not been described outside the HOPE-project before. The extremely high adefovir and tenofovir resistance of the previously characterized multidrug-resistant isolate FvB 150-1 could not be explained solely by the known mutations rtA181T and rtN236T. It could be shown that in addition the substitution T76S located in the priming domain is responsible for this high resistance. The mutation T76S is the first known resistance mutation of HBV, which is located outside of the reverse transcriptase. Regardless of the HOPE-project the influence of some substitutions were tested, which were described in a recently published study. The mutations were found more often in patient with virological breakthrough than in untreated patients. However, the determined phenotypic data showed that the exchanges rtS78T, rtL229F/V and rtM309K probably not acted as resistance mutations