Inhibition of HIF prolyl 4-hydroxylases protect endothelial cells from apoptosis

In the present study a new approach against the ongoing apoptotic cell death during hypoxia/reoxygenation (H/R) in endothelial cells was established. Particularly, the activation of hypoxia-inducible factor (HIF-1alpha), plays an essential role in triggering cellular protection during hypoxia, but it’s rapidly degradation during reoxygenation, may limit its effect on cell survival to the hypoxic period alone. Regulation of HIF-1alpha expression is controlled by repression of oxygen-dependent prolyl 4-hydroxylases (PHD) during hypoxia. The present study was conducted to elucidate the molecular mechanism by which inhibition of PHD pathway leads to protection of endothelial cells against ongoing apoptotic cell death during H/R. The study was performed using an established model of cultured monolayers of human umbilical vein endothelial cells to test the hypothesis that stabilization of HIF-1alpha beyond hypoxia exerts anti-apoptotic effects during H/R by preventing p53-mediated apoptosis. Cells were serum starved for 12 h, then exposed to 1 h of hypoxia (Po2 < 5mmHg) followed by 24 h of reoxygenation (Po2=140mmHg). Exposure to hypoxia caused an increase in HIF-1alpha and p53 content. During reoxygenation HIF-1alpha declined towards basal level, while p53 remained unaltered. Under the same conditions, endothelial apoptosis was increased to 58% (annexin V staining). Silencing of PHD2, led to an increase of the HIF-1alpha content during hypoxia and maintained it at that level during reoxygenation. HIF-1alpha stabilization was associated by an increase in the Mdm2 content, whereas expression of p53 was reduced. PHD2 silencing reduced apoptosis to half. Additon of DMOG (1mM, dimethyloxalyl glycine), a PHD inhibitor, at the onset of reoxygenation had the same effect. Reduction of p53 content was restored when the proteosome inhibitor MG-132 was added. Interaction of Mdm2 and p53 (coimmunoprecipitation) was increased compared to reoxygenation. Downregulation of HIF- 1alpha by siRNA increased apoptosis to 60% and abrogated Mdm2-p53 complex formation. Downregulation of Mdm2 by siRNA had no effect on HIF-1alpha but increased p53 level. Stabilization of HIF-1alpha due to PHD inhibition beyond the period of hypoxia defines a novel mechanism that exerts anti-apoptotic effects during H/R injury by preventing p53-mediated apoptosis and identifies PHD2 as a new molecular target for therapeutic intervention.In der vorliegenden Studie wurde eine neue Methode gegen die anhaltende Apoptose während der Hypoxie/Reoxygenierung (H/R) in Endothelzellen (EC) etabliert. Die Aktivierung des Hypoxie-induzierten Faktors (HIF-1alpha) spielt eine besondere Rolle in der Auslösung zellulärer Schutzmechanismen bei Hypoxie, welcher bei Reoxygenierung jedoch schnell zersetzt wird, so dass diese Rolle vermutlich auf die hypoxische Phase beschränkt ist. Die HIF-1alpha;-Expression wird durch die Hemmung der sauerstoffabhängigen Prolyl 4-Hydroxylasen (PHD) während der Hypoxie reguliert. Diese Studie wurde durchgeführt, um den molekularen Mechanismus zu finden, der durch die Hemmung des PHD-Weges zum Schutz der EC vor Apoptose nach H/R führt. Diese Studie nutzte ein etabliertes Modell in humanen Endothelzellen der Nabelschnurvene, um die Hypothese zu testen, ob die Stabilisierung von HIF-1alpha nach der Hypoxiephase anti-apoptotische Effekte während der H/R Schädigung aufzeigt, indem die p53-vermittelte Apoptose gehemmt wird. Hierfür wurde den Zellen zunächst für 12 Stunden das Serum im Kulturmedium entzogen. Anschließend wurden die EC für eine Stunde einer Hypoxie gefolgt von 24 Stunden Reoxygenierung ausgesetzt. Die Hypoxie verursachte einen Anstieg von HIF- 1alpha und p53. Während der Reoxygenierung fiel HIF-1alpha auf niedrige Konzentrationen ab, doch die p53 Konzentration blieb unverändert. Unter den gleichen Bedingungen stieg die Apoptoserate der EC auf 58% (Annexin V Färbung). Das Ausschalten des PHD2- Gens führte zu einem Anstieg an HIF-1alpha während der Hypoxie und gleich hohem HIF- 1alpha-Gehalt bei der Reoxygenierung. Die Stabilisierung des HIF-1alpha war assoziiert mit einem Anstieg an Mdm2 und einer verringerten Exprimierung von p53. Das Ausschalten des PHD2-Gens führte zu einer Halbierung der Apoptoserate. Der Zusatz von DMOG (1mM, Dimethyloxalyl glycin), einem PHD Inhibitor, zu Beginn der Reoxygenierung zeigte den gleichen Effekt. Die Reduktion des p53 wurde durch den Proteosomen inhibitor MG-132 aufgehoben. Die Interaktion zwischen Mdm2 and p53 (Coimmunopräzipation) war im Vergleich mit der Reoxygenierung erhöht. Downregulation von HIF-1alpha siRNA erhöhte die Apoptoserate auf 60% und hob die Mdm2-p53- Komplexbildung auf. Downregulation von Mdm2 durch siRNA zeigte keinen Effekt auf HIF-1alpha, erhöhte jedoch die Konzentration an p53. Die Stabilisierung von HIF-1alpha über dieHypoxiephase hinaus zeigt einen neuen Schutzmechanismus vor einer endothelialen H/R-Schädigung auf. Dieser Protektionsmechanismus beruht auf einer Inhibition der p53-vermittelten Apoptose und identifiziert PHD2 als ein neues molekulares Ziel für die therapeutische Intervention