Effects of hypoxia-induced and pharmacological stabilization of the hypoxia-inducible factor (HIF) on early mouse brain maturation

Hypoxie stimuliert physiologische sowie pathologische Prozesse während der frühen Gehirnentwicklung. Ein Schlüsselfaktor für die adaptive Reaktion von Zellen und Geweben auf Hypoxie ist der Hypoxie-induzierbare Transkriptionsfaktor (HIF). Er reguliert Gene, die für Zellproliferation, -überleben sowie Apoptose eine Rolle spielen. Hypoxie und Ischämie zählen zu den Hauptursachen perinatal erworbener ZNS-Läsionen. Das Ausmaß der Schädigung hängt von Dauer und Schweregrad des hypoxischen Insults sowie vom Entwicklungsstadium des Gehirns ab. Ziel vorliegender Arbeit war die Charakterisierung der Effekte einer Hypoxie-induzierten und pharmakologischen (Prolyl-4-Hydroxylase-Inhibitor (PHI) FG-4497) HIF-Stabilisation auf entwicklungsrelevante Faktoren des unreifen Gehirns. Um Hypoxie-induzierte Effekte von altersspezifischen Regulationen differenzieren zu können, wurde die physiologische Expression von HIF-1α und HIF-Zielgenen in Relation zum Entwicklungsalter analysiert. Mittels Real-Time-PCR, Western Blot (WB) und Immunfluoreszenz (IF) wurde die altersassoziierte Expression von HIF-1α, Chemokinrezeptor 4 (CXCR4), Stromal cell-derived factor 1 (SDF-1) und Doublecortin (DCX) im Gehirn der Maus (P0-P60) untersucht. Der Einfluss von Hypoxie (akut: 8% O2, 6h; chronisch: 10% O2, 7d) auf das neonatale Gehirn wurde am Modell der perinatalen systemischen Hypoxie analysiert. Es wurde die zerebrale Expression von VEGF, EPO, CXCR4, SDF-1 und DCX unter Hypoxie ermittelt. Mittels IF wurde die regionenspezifische Neurogenese (DCX) im zerebralen parietalen Kortex und Hippocampus bestimmt. Durch Einsatz des pharmakologischen HIF-Stabilisators PHI FG-4497 (30-130mg/kg; 6h, 12h) wurden systemische Effekte (Hämatokrit, Körpergewicht, ZNS/Körpergewicht-Ratio) sowie HIF-Akkumulation und HIF-Zielgen-Expressionen von VEGF, ADM, EPO, CXCR4, BNIP3 unter einer HIF-Stimulation unter Normoxie in Niere und Gehirn analysiert. Die altersspezifischen Expressionsmuster zeigten insbesondere in der frühen postnatalen Phase hohe Konzentrationen von HIF-1α-Protein sowie von CXCR4- und DCX-mRNA. Dies impliziert deren große Bedeutung für Reifungsprozesse in dieser frühen postnatalen Phase der Gehirnentwicklung. Entsprechend der Tatsache, dass die Vulnerabilität des unreifen Gehirns in Relation zum Entwicklungsstadium sowie zu Dauer und Schweregrad der Hypoxie steht, wurden im vorliegenden Hypoxie-Modell unterschiedliche Expressionsmuster von HIF-Zielgenen sowie dem HIF-unabhängigem DCX festgestellt. Akute und chronische Hypoxie resultierte in einem signifikanten Anstieg von VEGF- und EPO-mRNA. An P7 war die Hypoxie-induzierte Regulation gegenüber P0 signifikant höher, was auf die Bedeutung des Entwicklungsalters bezüglich der Effekte von Hypoxie hinweist. Während an P0 unter akuter Hypoxie ein signifikanter Anstieg der DCX-mRNA detektiert wurde, fand sich unter chronischer Hypoxie ein signifikanter Abfall. Das spricht für den Einfluss von Dauer und Schweregrad einer Hypoxie auf das Ausmaß der Schädigung unreifer Neurone. Mittels IF zeigte sich, dass die auf mRNA-Ebene nachgewiesene Abnahme der DCX- Expression während der Reoxygenierung regional auftritt. Nach akuter Hypoxie und 7d Reoxygenierung war eine Reduktion DCX-positiver Zellen ausschließlich im Kortex, nicht aber im Hippocampus zu beobachten. Im Gegensatz zu der abnehmenden DCX-mRNA nach chronischer Hypoxie und 72h Reoxygenierung, konnte regional (Kortex, Gyrus dentatus) eine Zunahme DCX-positiver Zellen beobachtet werden. Diese Ergebnisse sprechen für die hohe Sensitivität dieser spezifischen ZNS-Regionen gegenüber Hypoxie, in denen möglicherweise eine gesteigerte Neurogenese als regenerativen Adaptationsmechanismus dient. Da bisher keine ausreichenden Therapiemöglichkeiten zur Behandlung Hypoxie-induzierter Gehirnschädigungen existieren, stellt der PHI FG-4497 als HIF-Stabilisator einen äußerst interessanten Therapieansatz dar. Vorliegende Daten sprechen für eine organspezifische (Gehirn, Niere), altersabhängige (P7, adult) sowie dosisabhängige (30, 60, 100, 130mg/kg) Wirksamkeit des PHI FG-4497 auf die Expression entwicklungsrelevanter Gene, die in die frühe Hypoxieadaptation involviert sind. Der Nachweis einer HIF-1/2α-Akkumulation unter Normoxie durch den PHI FG-4497 im Gehirn der neonatalen Maus spricht für seine Fähigkeit, die unreife Blut-Hirn-Schranke zu passieren. Abhängig von der Dosis zeigte sich anhand einer signifikanten Induktion spezifischer HIF-Zielgene (VEGF, ADM, EPO, CXCR4, BNIP3) eine funktionelle HIF-Aktivierung unter Normoxie in Niere und Gehirn der neonatalen Maus. Systemische Faktoren wurden infolge der PHI-Behandlung nicht beeinflusst. Vorliegende Ergebnisse zeigen den bedeutsamen Einfluss von HIF auf die Regulation zerebraler Gene, die in frühe Entwicklungsprozesse wie Neurogenese, Migration und Vaskulogenese involviert sind. Zudem liefert vorliegende Arbeit erste Hinweise auf einen neuen Therapieansatz für Hypoxie-induzierte ZNS-Schädigungen bei der neonatalen Maus.Hypoxia stimulates physiological as well as pathological processes during early brain development. A key regulator of cellular and tissue adaptation to hypoxic conditions is hypoxia-inducible transcription factor HIF. It modulates expression of several genes that are involved in proliferation, survival and apoptosis during growth and development. Besides its physiological role, hypoxia and ischemia are major causes of acquired perinatal brain lesions. The degree of a hypoxic insult depends on duration and severity of hypoxia and cerebral developmental stage. The purpose of the present study was to determine effects of hypoxia-induced or pharmacological (prolyl-4-hydroxylase-inhibitor (PHI) FG-4497) HIF-stabilization on crucial developmental factors in the immature mouse brain. To distinguish hypoxia-induced from age-related regulatory effects physiological expression of HIF-1α along with specific HIF-target genes was characterized. Using real-time PCR, western blot and immunofluorescence age-related expression of HIF-1α, several HIF-target genes including chemokine receptor 4 (CXCR4) and its ligand stromal cell-derived factor 1 (SDF-1) as well as HIF-independent marker of neurogenesis doublecortin (DCX) was determined in mouse brain (P0-P60). Effects of hypoxia on neonatal brain development were examined by a model of perinatal systemic hypoxia (acute: 8% O2, 6h ; chronic: 10% O2, 7d). Cerebral expression levels of VEGF, EPO, CXCR4, SDF-1 and DCX were determined. Region specific neurogenesis (DCX) in parietal cerebral cortex and hippocampus were analyzed by immunofluorescence. Cerebral and systemic effects of chemical stimulation of the HIF system in the neonatal mouse (P7) were analyzed by application of a pharmacological HIF-stabilizator PHI FG-4497. By western blot analysis the stabilization of oxygen-sensitive α–subunit of HIF under normoxia was examined. Moreover, systemic parameters (haematocrit, bodyweight and brain/body weight ratio) and PHI-induced regulation of specific HIF target genes (VEGF, ADM, EPO, CXCR4, BNIP3) in the brain and kidney were determined. Age-related expression patterns during early postnatal stage showed accumulated HIF-1 protein and increased DCX and CXCR4 mRNA levels, which are known to be involved in developmental processes during early brain maturation. According to the observations that vulnerability of the brain is related to the maturational stage as well as to duration and degree of the hypoxic insult, differential effects on the expression levels of these HIF-regulated target genes as well as of HIF-independent DCX were determined under acute and chronic hypoxia followed by reoxygenation. In both hypoxia models cerebral VEGF and EPO mRNA levels were significantly increased. Interestingly, hypoxia-induced up-regulation at P7 was more prominent compared to P0, supporting the role of developmental stage in adaptive hypoxia-induced effects. While acute hypoxia at P0 led to a significant increase of DCX mRNA levels, chronic hypoxia induced a significant decrease suggesting that neuronal degradation was related to duration and severity of hypoxia. By immunofluorescence the suggested decrease of DCX could be confirmed in response to acute hypoxia and reoxygenation exclusively in the cortex but not in the hippocampus. In contrast to decreased DCX mRNA levels under intrauterine chronic hypoxia and 72h of reoxygenation an increasing trend of DCX-positive cells was observed in cerebral cortex and dentate gyrus. These results suggest a high sensitivity to hypoxia in specific cerebral regions indicating increased neurogenesis as a regenerative adaptive mechanism. The absence of an adequate therapy for hypoxia induced brain damage distinguishes the prolyl hydroxylase inhibitor FG-4497 as a promising therapeutic approach. Present data indicate organspecific (brain, kidney), age-related (P7, adult) and dose-dependent (30, 60, 100, 130mg/kg) effects of PHI treatment on expression of HIF-regulated genes that are involved in early adaptive responses to hypoxia. Detection of specific stabilization of both isoforms HIF-1α and HIF-2α by the PHI FG-4497 in neonatal mouse brain confirms the ability of the PHI to penetrate through neonatal blood-brain-barrier. Depending on the dose, functional HIF activation under normoxia in the neonatal mouse could be observed by regulation of specific HIF target genes (VEGF, ADM, EPO, CXCR4, BNIP3) in brain and kidney of the neonatal mouse. Systemic parameters such as haematocrit, bodyweight and brain/bodyweight ratio showed no significant changes in response to PHI treatment. In conclusion, the present data demonstrate that cerebral HIF target gene expression is closely related to developmental processes including neurogenesis, migration and vasculogenesis during physiologic and pathologic hypoxic conditions. Furthermore, present study provides first insights in a possible novel therapeutic approach for hypoxia-induced damages in the neonatal mouse brain