Conducting Polymer-based Biohybrid Materials : Towards Microphysiological Chips and Soft Actuators for Bone Tissue Engineering

The human body is a complex system, consisting of different types of biomolecules and living matters, such as nucleic acids, proteins, carbohydrates, lipids, serum, cells, tissues, and organs. These complex biomolecules and living matters integrate and interact dynamically to perform and maintain body functions. However, it is very difficult to study these biomaterials in vivo due to intricated relationship of biomaterials within complex body systems. Thus, researchers usually conduct an initial in-depth analysis of substances in vitro, then apply them in vivo for disease treatments or tissue repair. Recently, Hara et al. had a fantastic finding that chondrocyte-derived plasma membrane nanofragments (PMNFs) can induce bone-like tissue in vitro for only two days, while live cells or other biomaterials require at least 2-4 weeks. This effect of PMNFs is highly desirable, particularly for those elderly with osteoporosis and those with bone injuries who require rapid bone growth and repair. Recent studies have increasingly supported the notion that some non-biological materials provide important microenvironmental cues to support the activity of cells in in vitro conditions or within tissues. Based on these, living matters or biomolecules can be combined with or incorporated within specific non-biological material to create a microenvironment that further enhances cellular functions toward, for instance, combating infections and cancers or promoting tissue repair. In these cases, the materials combining biomolecules and/or living matters with non-biological materials are called biohybrid materials. Conducting polymers, e.g., polypyrrole (PPy), have become a class of promising non-biological material for the development of biohybrid materials due to their good biocompatibility, electronic/ionic conductivity, reversible volume change and switchable surface properties. Thus, in this thesis, we developed biohybrid material-based devices by the combination of PMNFs and PPy for the application in bone regeneration. Firstly, as early attempts for mimicking the in vivo microenvironment to study the functions of biomolecules in vitro, bovine serum albumin (BSA) was used as a simple model of biomolecule instead of complex biomolecules. A preliminary electrophysiological chip was fabricated by immobilising BSA on the surface of PPy synthesised with polycarboxylic acid as dopant. Then the switching presentation of BSA induced by the redox state of PPy surface was further evaluated. The results showed that it is feasible to immobilise biomolecules or living matters on polycarboxylic acid doped PPy, and that the presentation of these biomolecules on PPy surface could be switched by redox potential. On the basis of the preliminary BSA electrophysiological chip, a functional electrophysiological chip with bone regeneration potential was developed by immobilising PMNFs on the PPy surface. Despite the large size of the PMNFs, the results demonstrated that the PMNFs could be successfully immobilised on the PPy surface, and that the presentation of PMNFs could also be modified by changing the redox state of the PPy surface. Moreover, the incubation of the PMNFs-based chips in mineralisation medium resulted in the formation of minerals, and the morphological structures of the minerals were different under the stimulation of redox potential. Furthermore, the different microstructural morphologies of the formed minerals can modulate the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs). Secondly, based on the surface mineralisation study on the above electrophysiological chip at a two-dimensional (2D) scale, soft and biohybrid actuators based on PMNF-PPy biohybrid material were further developed for the deeper exploration of the bone regeneration at a three-dimensional (3D) scale. This is facilitated by the actuation of the soft and biohybrid actuator, which can achieve complex motions with on-demand geometry and actuation modalities in 3D. Therefore, a double layer of free-standing soft actuator was fabricated by combining PDMS passive layer and PPy active layer, while PMNFs were either immobilised on the PPy surface or doped into the PPy film. The actuation of PDMS/PPy-PMNF actuators proved that the mineralisation of PMNFs could increase the stiffness of the actuator and decrease the movement of actuator to some extent, although this reduction of movement was not significant. The results indicate that the mineralisation of PMNFs possesses a variable stiffness effect in soft actuators. Next, an alginate gel (Alg)-PPy actuator was developed in order to achieve an actuator that is more sensitive to variable stiffness change and that performs more distinguished movement changes. In this experiment, PMNFs were incorporated into the alginate gel. The alginate gel functionalised with PMNFs facilitated the formation of a thick mineral layer, which almost completely suppressed the actuator movement. Finally, the patterned Alg-PPy actuator was smartly morphing on the bone for mineralisation. Excitingly, the mineralised actuator was integrated into the bone, demonstrating the potential application of PMNF-PPy biohybrid materials for bone regeneration. Människokroppen är ett komplext system som består av olika typer av biomolekyler och levande ämnen, såsom nukleinsyror, proteiner, kolhydrater, lipider, serum, celler, vävnader och organ. Dessa komplexa biomolekyler och levande ämnen integreras och interagerar dynamiskt för att utföra och upprätthålla kroppsfunktioner. Det är dock mycket svårt att studera dessa biomaterial in vivo på grund av det invecklade förhållandet mellan biomaterial inom komplexa kroppssystem. Således gör forskare vanligtvis en inledande djupgående analys av ämnen in vitro och applicerar dem sedan in vivo för sjukdomsbehandlingar eller vävnadsreparation. Nyligen har Hara et al. hade en fantastisk upptäckt att kondrocythärledda plasmamembrannanofragment (PMNF) kan inducera benliknande vävnad in vitro i endast två dagar, medan levande celler eller andra biomaterial kräver minst 2-4 veckor. Denna effekt av PMNF är mycket önskvärd, särskilt för de äldre med osteoporos och de med benskador som kräver snabb bentillväxt och -reparation. Nyligen genomförda studier har alltmer stött uppfattningen att vissa icke-biologiska material tillhandahåller viktiga mikromiljömässiga signaler för att stödja aktiviteten hos celler under in vitro-förhållanden eller i vävnader. Baserat på dessa kan levande ämnen eller biomolekyler kombineras med eller inkorporeras i specifikt icke-biologiskt material för att skapa en mikromiljö som ytterligare förbättrar cellulära funktioner mot till exempel att bekämpa infektioner och cancer eller främja vävnadsreparation. I dessa fall kallas de material som kombinerar biomolekyler och/eller levande ämnen med icke-biologiska material för biohybridmaterial. Ledande polymerer, t.ex. polypyrrol (PPy), har blivit en klass av lovande icke-biologiska material för utveckling av biohybridmaterial på grund av deras goda biokompatibilitet, elektroniska/joniska konduktivitet, reversibla volymförändringar och omkopplingsbara ytegenskaper. I detta examensarbete har vi därför utvecklat biohybridmaterialbaserade enheter genom kombinationen av PMNF och PPy för tillämpning vid benregenerering. För det första, som tidiga försök att efterlikna mikromiljön in vivo för att studera funktionerna hos biomolekyler in vitro, användes bovint serumalbumin (BSA) som en enkel modell av biomolekyl istället för komplexa biomolekyler. Ett preliminärt elektrofysiologiskt chip tillverkades genom att immobilisera BSA på ytan av PPy syntetiserat med polykarboxylsyra som dopningsmedel. Därefter utvärderades växlingspresentationen av BSA inducerad av redoxtillståndet för PPy-ytan ytterligare. Resultaten visade att det är möjligt att immobilisera biomolekyler eller levande ämnen på polykarboxylsyradopad PPy, och att presentationen av dessa biomolekyler på PPy-ytan kunde ändras med redoxpotential. På basis av det preliminära BSA elektrofysiologiska chipet utvecklades ett funktionellt elektrofysiologiskt chip med benregenereringspotential genom att immobilisera PMNF på PPy-ytan. Trots den stora storleken på PMNF:er visade resultaten att PMNF:er framgångsrikt kunde immobiliseras på PPy-ytan och att presentationen av PMNF:er också kunde modifieras genom att ändra redoxtillståndet för PPy-ytan. Dessutom resulterade inkubationen av de PMNF-baserade chipsen i mineraliseringsmedium i bildning av mineraler, och de morfologiska strukturerna hos mineralerna var olika under stimulering av redoxpotential. Dessutom kan de olika mikrostrukturella morfologierna hos de bildade mineralerna modulera den osteogena differentieringen av mesenkymala stamceller (MSC). För det andra, baserat på ytmineraliseringsstudien på ovanstående elektrofysiologiska chip i en tvådimensionell (2D) skala, vidareutvecklades mjuka och biohybridställdon baserade på PMNF-PPy biohybridmaterial för den djupare utforskningen av benregenereringen vid en tredimensionell (3D) skala. Detta underlättas av aktiveringen av det mjuka och biohybrida ställdonet, som kan åstadkomma komplexa rörelser med on-demand geometri och aktiveringsmodaliteter i 3D. Därför tillverkades ett dubbelt lager av fristående mjukt manöverdon genom att kombinera PDMS passivt lager och PPy aktivt lager, medan PMNF antingen immobiliserades på PPy-ytan eller dopades in i PPy-filmen. Aktiveringen av PDMS/PPy-PMNF-ställdon visade att mineraliseringen av PMNF kunde öka ställdonets styvhet och minska ställdonets rörelse i viss utsträckning, även om denna minskning av rörelsen inte var signifikant. Resultaten indikerar att mineraliseringen av PMNF har en variabel styvhetseffekt i mjuka ställdon. Därefter utvecklades ett alginat gel-PPy ställdon för att uppnå ett ställdon som är mer känsligt för förändringar i variabel styvhet och som utför mer distingerade rörelseförändringar. I detta experiment införlivades PMNF i alginatgelen. Alginatgelen funktionaliserad med PMNF underlättade bildandet av ett tjockt minerallager, vilket nästan helt undertryckte manöverorganets rörelse. Slutligen förvandlades den mönstrade alginatgel-PPy-aktuatorn smart på benet för mineralisering. Spännande nog integrerades det mineraliserade manöverdonet i benet, vilket visar den potentiella tillämpningen av PMNF-PPy biohybridmaterial för benregenerering