Enzimas antioxidantes como potenciais alvos do metilglioxal: cinética inibitória da glutationa redutase

TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Biologia.O metilglioxal (MGO) é uma toxina endógena sintetizada principalmente pela via glicolítica. Por possuir duas carbonilas, esse composto é um importante agente glicante fisiológico, capaz de reagir com lipídeos, proteínas e nucleotídeos. Baixos níveis de MGO são mantidos através do sistema enzimático da glioxalase, no qual ele é degradado a D-lactato pelas enzimas Glo1 e Glo2. Estudos já demonstraram que a reação do MGO com várias enzimas leva à alteração de suas atividades e ao aumento da produção de espécies reativas, podendo resultar em alterações fisiológicas, como observado em diversas patologias. Sendo assim, se torna importante o estudo dos mecanismos de ação inibitória do MGO sobre as enzimas. No presente trabalho foi analisado o efeito inibitório in vitro do MGO sobre a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa redutase (GR), tiorredoxina redutase (TrxR), glutationa peroxidase (GPx) e glioxalase 1 (Glo1). Foram utilizados extratos de córtex cerebral para todas as enzimas, enquanto a atividade CAT também foi avaliada em extrato de fígado de camundongo. As enzimas SOD, CAT e GR foram estudas, tanto em extrato como nas suas formas purificadas. Também, foram avaliadas as propriedades cinéticas de inibição in vitro do MGO sobre a atividade GR em sua forma purificada. Os dados obtidos demonstram que concentrações crescentes de MGO (1-25 mM) foram capazes de inibir a atividade GPx (73%), Glo1 (90%) e TrxR (~50%) no extrato de córtex cerebral, e a atividade GR na sua forma purificada (83%). Na presença de MGO, a atividade SOD no extrato de córtex cerebral não foi inibida, havendo inibição apenas sobre a enzima purifica (57%). A atividade CAT não apresentou inibição em extrato de córtex cerebral e nem sobre a enzima purificada. Os dados da cinética inibitória do MGO sobre a atividade GR em relação ao substrato NADPH demonstraram que o tratamento com MGO levou a uma diminuição da velocidade máxima (Vmáx), de 862,1 nmol/min para 151,6 nmol/min, e da constante de Michaelis (Km aparente), de 0,033 mM para 0,010 mM, apresentando um tipo de inibição incompetitiva. Em relação ao substrato GSSG, o tratamento com MGO diminuiu a Vmáx, de 789,3 nmol/min para 145,6 nmol/min, enquanto os valores de Km aparente se mantiveram estáveis, em torno de 0,26 mM. Esse tipo de inibição pode ser enquadrado no tipo não competitiva. Em conclusão, os dados demonstraram o potencial inibitório do MGO, contribuindo para o melhor entendimento dos mecanismos da sua interação com enzimas antioxidantes.Methylglyoxal (MGO) is an endogenous toxin, synthesized mainly by the glycolytic pathway. MGO as a dicarbonyl molecule, is an important glycating agent, capable of reacting with lipids, proteins and nucleotides. Low levels of MGO are maintained by glyoxalase pathway, comprising by the enzymes Glo1 and Glo2, that catalyses D-lactate formation from MGO. Previous studies have already shown that the reaction of MGO with various enzymes leads to changes in its activities and increase the production of reactive species, which can result in physiological complications, as observed in several pathologies. Therefore, it is important investigate the inhibitory mechanisms of MGO on enzymes. Thus, in the present work, it was analyzed the in vitro inhibitory effect of MGO on the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione reductase (GR), thioredoxin reductase (TrxR), glutathione peroxidase (GPx) and glyoxalase 1 (Glo1) enzymes. Mice cerebral cortex extracts were used for all enzymes, while CAT was also evaluated in mice liver extract. The enzymes SOD, CAT and GR were studied, both in extract and in their purified forms. In addition, it was analyzed the kinetic properties of MGO inhibition on GR activity. The results demonstrated that increasing concentrations of MGO (1-25 mM) were able to inhibit the GPx (73%), Glo1 (90%) and TrxR (~ 50%) activities in the cerebral cortex extract, and the GR activity (83%) in the purified enzyme. In the presence of MGO, the SOD activity in the cerebral cortex extract was not inhibited, the inhibition was only observed in the purified enzyme (57%). CAT activity showed no inhibitory effect either in cerebral cortex extract and in the purified enzyme. Treatment with MGO led to a decrease in the maximum velocity (Vmax), from 862.1 nmol/min to 151.6 nmol/min, and the Michaelis constant (apparent Km) from 0.033 mM to 0.010 mM, presenting an uncompetitive inhibition in the GR activity related to the NADPH substrate. In relation to the GSSG substrate, the treatment with MGO decreased the Vmax, from 789.3 nmol/min to 145.6 nmol/min, whereas the apparent Km values remained stable, around 0.26 mM. This type of inhibition can be classified as non-competitive. In conclusion, the data demonstrated the presence of inhibitory potential of MGO, contributing to a better understanding of its interaction mechanisms with antioxidant enzymes