Differential subcellular expression of MICA alleles in a celiac disease cell culture model

Einführung: Die Expression von MICA, einem atypischen MHC-Klasse-I-Molekül, wird in der Zöliakie durch Gliadinpeptide und sekundär durch Interleukin-15 erhöht. Als Ligand des NKG2D-Rezeptors auf intraepithelialen Lymphozyten (IELs) führt die MICA/NKG2D- Interaktion zur Lyse des intestinalen Epithels. MICA-Allele zeigen einen hohen Polymorphismus. In der Literatur ist beschrieben, dass viele Zöliakiepatienten das trunkierte MICA-Allel A5.1 aufweisen und die Klinik oft einen abgemilderten, symptomatischen Verlauf annimmt. Zur Untersuchung der differenziellen zellulären Kompartimentierung des trunkierten MICA-Allels MICA*008 im Vergleich zu dem nicht trunkierten Allel MICA*019 und der pathophysiologischen Folgen auf die Interaktion mit IELs, exprimierten wir die verschiedenen MICA-Allele in einem Zellmodell aus intestinalen Epithelzellen (IEC). Ziele: In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob die differenzielle Kompartimentierung der MICA-Isoformen MICA*008 und MICA*019 in einem humanen IEC-Zellsystem nachvollziehbar ist. Stabil MICA*008-, MICA*019- und MICB-exprimierende Zellklone sollten generiert und hierbei die mögliche Interaktion von MICA-exprimierenden Epithelzellen und IELs diskutiert werden. Methoden: Mittels Subklonierung wurden MICA/-B-Konstrukte (MICA*008 als trunkiertes Allel, MICA*019 als nicht-trunkiertes Allel sowie MICB als Kontrolle) generiert und in Caco-2- bbe-Zellen transient sowie stabil exprimiert. Neben Wildtypkonstrukten wurden Konstrukte mit einem HA-Tag hergestellt. In der konfokalen Mikroskopie nach Immunfärbung sowie durchflusszytometrisch wurde die differenzielle Kompartimentierung charakterisiert, mittels Western Blotting wurde die Expression des trunkierten MICA*008 untersucht. Stabil MICA*008- und MICA*019-exprimierende Caco-2-bbe-Zellen wurden hinsichtlich ihrer epithelialen Barrierefunktion (transepithelialer Widerstand, TER) untersucht. Resultate: Die nicht-trunkierten Allele MICA*019 und MICB werden membranös exprimiert, während das trunkierte MICA*008 hauptsächlich intrazellulär lokalisiert. MICA*008 zeigte sich im Zytosol sowie submembranös in vesikelartigen Formationen, eine Kolokalisation mit Zellmembranproteinen fand sich nicht. Eine apikale Sortierung von MICA*008 konnte nicht eindeutig beobachtet werden. MICA*019 fand sich in der basolateralen Zellmembran und zeigte deutliche Kolokalisationen mit basolateralen Membranproteinen. Im Western Blot zeigten Banden das Vorliegen kleinerer MICA*008-Moleküle im Vergleich zu den nicht-trunkierten MICA/-B-Proteinen. In der Durchflusszytometrie sahen wir ein vom Genotyp abhängiges Verhältnis von intrazellulärer zu oberflächlicher MICA-Expression. In TER-Messungen zeigten MICA*008-exprimierende Zellen geringere Werte. Schlussfolgerungen: Es konnte gezeigt werden, dass die subzelluläre Kompartimentierung von MICA Genotyp-abhängig ist. Das bei Zöliakiepatienten häufig vorkommende Allel MICA*008 wird – anders als das Wildtyp-Allel des MICA – nicht transmembranös exprimiert, sondern lokalisiert im Zytosol und submembranös. Der gehäuft vorkommende symptomatische Verlauf der Zöliakie bei Trägern des MICA-A5.1-Allels könnte somit als Konsequenz der verminderten Aktivierung des NKG2D-Rezeptors verstanden werden. Perspektivisch sollten die stabil MICA*008- und MICA*019-exprimierenden IEC-Konstrukte hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber NK-Rezeptor-verursachter Lyse untersucht werden.Introduction: In celiac disease, MICA is upregulated in the presence of gliadin peptides and secondarily by IL-15. MICA acts as ligand for the NKG2D receptor expressed on intraepithelial lymphocytes (IELs). The interaction of the ligand with its receptor leads to epithelial lysis and is a crucial factor in the development of an epithelial barrier defect in celiac disease. As shown in a preceding study, many celiacs are carriers of the truncated allele MICA-A5.1 (MICA*008). Since the clinical course of these carriers is often oligosymptomatic, we expressed this allele in intestinal epithelial cells (IEC) and compared the subcellular localization of MICA*008 to the non-truncated MICA*019 and MICB alleles. Aims of the study: This study examines the differential subcellular localization of MICA proteins by visualizing MICA in transfected Caco-2-bbe cells. We aimed to reconstruct the interaction between IELs and MICA-expressing intestinal epithelial cells and thus to shed a light on how the MICA genotype affects the subcellular MICA localization. Methods: MICA*008 (MICA-A5.1, truncated allele), MICA*019 (non-truncated allele), and MICB were subcloned into the vector pCI-puro, and transiently as well as stably expressed in Caco-2-bbe cells. The subcellular localization of MICA/-B was examined by confocal microscopy after immunostaining, western blotting and flow cytometry. Stably MICA*008- and MICA*019-expressing Caco-2-bbe cells were examined for barrier function (transepithelial resistance, TER). Results: Confocal microscopy confirmed the differential compartmentalization of the MICA alleles: MICA*008 localized intracellularly, whereas MICA*019 and MICB were predominantly expressed on the cell membrane. Furthermore we observed a submembranous vesicular arrangement of MICA*008. Colocalization with apical or basolateral membrane proteins has not been observed in MICA*008-expressing cells. MICA*019 localized in the basolateral cell membrane and displayed colocalizations with membrane proteins. Western blotting revealed a specific band of the truncated molecule MICA*008 in comparison to the larger MICA*019 protein. Flow cytometry confirmed that the ratio of intracellular to surface MICA expression is genotype-dependent. In TER measurements, MICA*008-expressing cells showed significantly lower values. Conclusion: The localization of MICA is dependent on the MICA genotype. MICA*008 localized in the cytosol whereas MICA*019 was found in the cell membrane. This supports the hypothesis that an altered clinical course with absent or reduced gastrointestinal symptoms in MICA-A5.1 carriers is secondary to a lack of activation of the NKG2D receptor. In perspective, stable constructs of MICA*008 and MICA*019 should be analyzed regarding their viability in the presence of NK receptor-bearing cells to examine the interaction