Time- and polarization resolved multi-photon microscopy: fluorescence lifetime imaging and two-color two-photon anisotropy measurements

In dieser Arbeit werden biologische Stoffwechselprozesse in vivo und physikalisch-chemische Eigenschaften von Molekülen mit zeit- und polarisationsaufgelöster Multiphotonenmikroskopie untersucht. Mit einem selbstkonstruierten Zweiphotonen-Laserscanningmikroskop wurden die relativen Konzentrationen der freien und enzymgebundenen Formen des wichtigen Koenzyms NAD(P)H in Pankreasinseln und einzelnen Beta-Zellen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen durch simultane Intensitäts- und bildgebende Fluoreszenzlebensdauermessungen (FLIM) bestimmt. Zusätzlich wird eine Bestimmung der relativen Calciumionenkonzentration in Zellen durch FLIM-Messungen mit verschiedenen Fluorophoren durchgeführt. Weiterhin werden erstmals sogenannte „Komplette Polarisationsexperimente“ praktisch demonstriert. Sie werden als „komplett“ bezeichnet, da man mit ihnen die maximal ermittelbare Information über den Prozess der simultanen Absorption zweier Photonen und der induzierten Fluoreszenz von Molekülen in Lösung erhält. Die Experimente wurden mit einem selbstkonstruierten Zweifarben-Zweiphotonen-System realisiert, bei dem Femtosekundenpulse verschiedener Farbe (800 nm und 400 nm) und Polarisationen gleichzeitig absorbiert werden. Die Anisotropie der induzierten Fluoreszenz wird zeitaufgelöst mit einem zeitkorrelierten Einzelphotonen-Zähl-System (TCSPC) gemessen. Exemplarische Daten von Messungen an den UV-Fluorophoren para-terphenyl, 2,5-Diphenyl-1,3,4-oxadiazol und Indol in Lösung werden gezeigt und Auswertemethoden präsentiert, mit denen man aus experimentellen Daten Rückschlüsse auf die involvierten intermediären Zustände, die Symmetrie der elektronisch angeregten Zustände und die relative Ausrichtung des Emissionsdipolmoments von Molekülen ziehen kann.In this thesis biological metabolism processes in vivo and physicochemical properties of molecules are investigated by time and polarization resolved multi-photon microscopy. The relative concentrations of free and protein-bound coenzyme NAD(P)H in pancreatic islets and single beta-cells are determined by simultaneous intensity and fluorescence lifetime imaging (FLIM) measurements with a custom-built two-photon laser scanning microscope under various physiological conditions. Additionally, the relative concentration of calcium ions is examined in cells by FLIM using various fluorophores. Furthermore so-called ôcomplete polarization experimentsö are presented for the first time. They are called ôcompleteö because they provide the maximal information that can be obtained about the two-photon absorption process and the induced fluorescence of molecules in solution. The experiments were performed with a custom-built two-color two-photon-system where femtosecond pulses of different color (800 nm and 400 nm) and polarizations that are synchronized in time and space are absorbed simultaneously by molecules. The anisotropy of the induced fluorescence is measured with a time correlated single photon counting system (TCSPC). Exemplary experimental data for the UV-fluorophores para-terphenyl, 2,5-diphenyl-1,3,4-oxadiazole and indole in solution is shown and a guideline is presented how to obtain complete information about the involved intermediate states, the symmetry of the excited states and the relative direction of the emission dipole moments from experimental data