New advancements in highly sensitive time-resolved fluorescence two-photon microscopy: Theoretical approaches and bioscientific applications

A central methodological aim of the biosciences is to experimentally simulate, as good as possible, the real environmental conditions of biological systems in order to gain a true image of the effects and processes of interest. Thus, the bioscientific research is moving from test-tube observations towards in vivo investigations in intact cells and tissues. In this frame, the development of biophysical techniques, which allow an accurate and highly sensitive registration of changes in the studied system without disturbing the natural processes therein, is particularly significant. Especially the fluorescence laser microscopy provide a large diversity of versatile tools for bioscientific studies. In this work, two new theoretical approaches are developed, which allow an extended comprehension of the single-molecule fluorescence fluctuation microscopy based on two-photon excitation, one of the most sensitive techniques for biological investigations. Moreover, novel non-invasive fluorescence lifetime imaging experiments are performed, which enable us a detailed and accurate insight in the cellular NAD(P)H-metabolism and in the functionality of artificial skin as an organ.Eines der Hauptziele in den Biowissenschaften ist es, die tatsächliche Umgebung biologischer Systeme experimentell zu simulieren, um eine naturgetreue Abbildung der wichtigen Effekte und Prozesse in diesen Systemen zu erhalten. Aus diesem Grund entfernt sich die biowissenschaftliche Forschung von Untersuchungen im Reagenzglas und widmet zunehmend den Experimenten in intakten Zellen und Geweben Aufmerksamkeit. In diesem Zusammenhang ist die Entwicklung biophysikalischer Verfahren besonders wichtig, die eine sehr genaue und hoch-sensitive Aufnahme der Veränderungen in dem zu untersuchenden System erlauben, ohne dass die darin ablaufenden natürlichen Prozesse gestört werden. Besonders die Fluoreszenz-Laser-Mikroskopie stellt eine große Auswahl an Verfahren für biowissenschaftliche Untersuchungen zu Verfügung. In dieser Arbeit werden zwei neue theoretische Modelle vorgestellt, die ein detailliertes Verständnis der, auf Zwei-Photonen-Anregung basierenden, Einzelmolekül-Nachweis-Fluoreszenz-Fluktuations-Mikroskopie ermöglichen. Diese Methode stellt eine der empfindlichsten und genausten Methoden für biologische Anwendungen dar. Außerdem werden neuartige, gewebeschonende Fluoreszenz-Lebensdauer-Imaging Experimente vorgestellt, die eine umfangreiche und quantitative Einsicht in den NAD(P)H Zellmetabolismus und in die Funktionalität künstlicher Haut als Organ zulassen