Characterization of the cell-associated Phospholipase A PlaB of Legionella pneumophila, the first characterized member of a novel lipase family

Legionella pneumophila verfügt über eine Vielzahl an Phospholipasen. Ein Vertreter der Phospholipasen A ist PlaB, das erste charakterisierte Mitglied einer neuen Lipasefamilie, welches sowohl hämolytische als auch Phospholipase A/Lysophospholipase A-Aktivitäten aufweist. Neben dem katalytisch aktiven Zentrum im N-terminalen Bereich besitzt PlaB eine C-terminale Region von etwa 170 Aminosäuren mit unbekannter Funktion. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bedeutung des C-Terminus näher analysiert. Es zeigte sich, dass jede einzelne polare Aminosäure innerhalb der letzten 15 Aminosäuren zur enzymatischen Aktivität von PlaB beiträgt. Mittels Zufallsmutagenese konnten 22 neue Aminosäuren identifiziert werden, deren Mutation einen Einfluss auf die Phospholipase A-Aktivität von PlaB bewirkt. Die erstmalige Reinigung von löslichem und aktivem PlaB ermöglichte die Generierung eines funktionellen PlaB-spezifischen Antikörpers. Strukturelle Analysen des gereinigten Strep-PlaB mittels Röntgenkleinwinkelstreuung, Größenausschlusschromatographie, chemischer Quervernetzung, Massenspektrometrie und analytischer Ultrazentrifugation ergaben, dass PlaB ein konzentrationsabhängiges Monomer-Dimer-Tetramer-Gleichgewicht ausbildet. Interessanterweise wies PlaB im nanomolaren Konzentrationsbereich, in welchem das Enzym als Monomer vorliegt, die stärkste spezifische Aktivität auf. Oberhalb von ~0,1 µM, wo PlaB als Dimer-Tetramer-Gleichgewicht existiert, war ein Rückgang der Aktivität zu beobachten. Bei Proteinkonzentrationen >5,4 µM, wo PlaB als Tetramer vorliegt, wurde keinerlei Aktivität festgestellt. Demnach assembliert sich PlaB im mikromolaren Konzentrationsbereich zum inaktiven Tetramer. Die Dissoziation des Komplexes bis hin zum Monomer im nanomolaren Konzentrationsbereich führt zur Aktivierung von PlaB. Diese konzentrationsabhängige Inaktivierung der PLA-Aktivität durch Tetramerisierung, stellt ein Mechanismus dar, welcher möglicherweise dem Selbstschutz von Legionella dient, wobei die Dissoziation des Enzyms seine Aktivierung nach dem Export erlauben könnte. Zelluläre Fraktionierungs-, Biotinylierungs- und Proteinase K-Zugänglichkeitsexperimente ergaben, dass PlaB als oberflächenassoziiertes Protein auf der äußeren Membran des Bakteriums lokalisiert ist. Allerdings ist das verantwortliche Sekretionssystem für den Export noch unbekannt. Sekretionsstudien mit N- und C-terminal verkürzten PlaB-Mutanten gaben jedoch Hinweise auf für die Translokation wichtige Proteinregionen.Legionella pneumophila comprises a variety of phospholipases. Among them, PlaB, the first described member of a novel lipase family, is a hemolytic virulence factor that exhibits phospholipase A/lysophospholipase A activities. Further, PlaB possesses a catalytically active site within the N-terminal region of the protein and a C-terminal extension of ~170 amino acids with unknown function. In the present study, analysis of the relevance of the C-terminus for enzymatic activity was further pursued, particularly with regard to the last 15 amino acids. It was shown that every polar amino acid within the last 15 amino acids contributes to the enzymatic function of PlaB. Furthermore, random mutagenesis identified 22 new amino acids impacting PlaB phospholipase A activity. In addition, soluble and active PlaB was purified in substantial amounts for the first time. This allowed the generation of a functional PlaB antibody. The structural analysis of purified Strep-PlaB by size exclusion chromatography, chemical cross-linking, mass spectrometry, small-angle X-ray scattering and analytical ultracentrifugation revealed that PlaB exists in a monomer/dimer/tetramer equilibrium. Interestingly, PlaB was most active in the range of nanomolar protein concentrations, where it was shown to exhibit a monomeric status. However, at protein concentrations above 0.1 µM, PlaB exists in a dimer/tetramer equilibrium and enzymatic activity is almost abolished. PlaB showed no activity at protein concentrations above 5.4 µM, where it occurs in a tetrameric form. In conclusion, we suggest a model of enzymatic activation in which PlaB assembles to form inactive tetramers at micromolar protein concentrations. Upon shifting to lower protein concentrations, the protein complex dissociates to monomers, thereby activating the enzymatic function of PlaB. As demonstrated by cellular fractionation, biotinylation and proteinase K digestion, PlaB is localized at the surface of the bacterial outer membrane. However, the mechanism responsible for PlaB secretion remains elusive. However, secretion analyses with C- and N-terminal truncated PlaB mutants indicate important regions for protein translocation. The present study describes the first example of concentration-dependent phospholipase inactivation by tetramerization, a mechanism, which may protect Legionella. The dissociation of the enzyme may allow the activation of PlaB after the export, though