Identification of hemolysis-associated factors of the lung pathogen Legionella pneumophila and characterization of the patatin-like phospholipase A PatA

Legionella pneumophila, der Erreger einer schwer verlaufenden Pneumonie, der Legionärskrankheit, besitzt neben bekannten Virulenzfaktoren wie z. B. einem Typ IVB-Sekretionssystem sowie dessen sekretierten Effektoren, eine Vielzahl potentiell zytolytisch wirkender Proteine (Proteasen, Lipasen und Hämolysine), die zur Pathogenität des Bakteriums und damit zur intrazellulären Vermehrung in Amöben und humanen Alveolarmakrophagen beitragen können. Zur Detektion zytolytischer Faktoren wurde ein Agarplatten-basiertes Screening-System angewandt, durch das 26 Gene identifiziert wurden, die vor allem das hämolytische Potential von L. pneumophila beeinflussten. Neben dem Gen für das L. pneumophila Hitzeschockprotein 33 (Hsp33) wurden zwei Gene, aroC und pabB, die für Enzyme des Shikimatweges bzw. der Folatbiosynthese codieren, als Hämolyse-assoziierte Faktoren identifiziert. Die aroC-Mutante war in ihrer Fähigkeit zur Pigmentbildung stark vermindert, während die pabB-Mutante einen intrazellulären Vermehrungsdefekt in Acanthamoeba castellanii aufwies. Für PatA, eine Patatin-ähnliche Phospholipase A von L. pneumophila, die über das Dot/Icm Typ IVB-Sekretionssystem in die Wirtszelle injiziert wird und hämolytische Eigenschaften besitzt, wurde sowohl Phospholipase A- als auch Lysophospholipase A-Aktivität gegenüber verschiedenen Phospholipidsubstraten inklusive Cardiolipin nachgewiesen. Für diese lipolytischen Aktivitäten war das in ein G-X-S-X-G-Lipasemotiv eingebettete Serin 72 als Bestandteil einer katalytischen Diade mit Aspartat 288 essentiell. Nach Expression in humanen A549 Lungenepithelzellen lokalisierte PatA an der Zytoplasmamembran der Wirtszelle, wofür der C-terminale Proteinbereich verantwortlich war. Die Deletion zweier C-terminaler Proteinregionen, einer low complexity-Region zwischen den Aminosäuren E519 bis E527 und einer putativen Transmembran-Domäne im Bereich der Aminosäuren K533 bis D555, führte zum vollständigen Verlust der Zytoplasmamembranlokalisation.The causative agent of the Legionnaires´pneumonia, Legionella pneumophila, possesses in addition to known virulence factors like the type IVB secretion system and its secreted effectors, many potentially cytolytic proteins (proteases, lipases and hemolysins), that could contribute to bacterial pathogenicity and therefore support intracellular replication in amoebae and human alveolar macrophages. For the detection of cytolytic agents an agar plate-based screening system was used. Here, 26 genes with an influence on mainly the haemolytic potential of L. pneumophila were identified. In addition to the gene coding for the L. pneumophila heat shock protein 33 (Hsp33), two genes, aroC and pabB, coding for enzymes of the shikimate pathway and folate biosynthesis, respectively, were identified as hemolysis-associated factors. The aroC mutant showed strongly reduced pigmentation while the pabB mutant was attenuated in intracellular infection of Acanthamoeba castellanii. PatA, a patatin-like phospholipase A of L. pneumophila that is injected into the host cells via the Dot/Icm type IV secretion system and exhibits hemolytic properties, showed phospholipase A as well as lysophospholipase A activities for different phospholipase substrates including cardiolipin. The amino acid, serine 72, embedded in a G-X-S-X-G lipase motif as a part of a catalytic diad with aspartate 288 was essential for these lipolytic activities. After expression in human A549 lung epithelial cells, PatA was located at the cytoplasmic membrane of the host cell and the C-terminal part of the protein was responsible for this localization. The deletion of two C-terminal protein regions, a low complexity region between amino acids E519 and E527 and a putative transmembrane domain within the range of amino acids K533 and D555, resulted in completely abolished localization at the cytoplasmic membrane