The anti-apoptotic proteins DJ-1 and Mcl-1: molecular basis of different protein-ligand interactions leading to apoptosis.

DJ-1 and Mcl-1 are two anti-apoptotic proteins involved in distinct severe diseases such as Parkinson disease (PD) and Cancer. Even though they belong to different protein families, both genes take part in the apoptotic process; also, DJ-1 lies upstream in a pathway that affects cell death through members of the Mcl-1 protein family. The first part of this thesis regards the effects of the conjugation of dopamine-derived quinones on DJ-1. Various functions have been ascribed to DJ-1 and many of these are linked with PD, such as a protective role against oxidative stress, either as a redox sensor or as an antioxidant protein. Oxidative stress is considered the major cause in neuronal death in PD and, in detail, the cause seems to involve the excessive oxidative stress generated by auto- and enzymatic oxidation of dopamine, which leads to the formation of highly reactive quinones (DAQs). The reactivity of DAQs toward DJ-1 in cells is reported in the literature, but the molecular basis and the related structural effects are not yet studied. DAQ are reactive toward nucleophilic atoms such as the thiolic sulfur atom in cysteine. The three cysteine residues seem to have very different roles in DJ-1: Cys106 is implicated in the oxidative activation of chaperone activity. The other two cysteines, Cys53 and Cys46, are located at the homodimer interface. The main objective of the thesis is the understanding of the structural modifications induced by the conjugation of DA onto the cysteine residues of DJ-1 using Molecular Dynamics, NMR, and Circular Dichroism (CD). The presence of different amounts of protein modified by one (+150 Da) or two (+300 Da) DAQs was confirmed by SDS-PAGE, radioactivity assay and mass spectroscopy. Interestingly, the same sample also showed the presence of a seemingly covalent dimer. To clarify which cysteine was involved in the dimerization, the same reaction was performed on two mutants, C106A and C53A. Covalent dimer formation was not detected in the C53A mutant. To characterize the structural modifications, we acquired several 1H-15N heteronuclear single quantum coherence (HSQC) spectra on the wt, C53A and C106A samples before and after DAQs treatment. Numerous modifications in the spectrum caused by the conjugation with DAQs were observed. Specifically, a notable number of peaks show a decrease in intensity, indicating a dynamic perturbation induced by DAQ conjugation. A molecular dynamics simulation study was used to explore the molecular basis of the covalent modification. We observed a different residue-fluctuation profile caused by the conjugation on Cys106, in agreement with NMR studies. We also provided a possible explanation of the molecular basis leading to dimerization. To clarify if covalent modification by dopamine may carry implications on the stability of DJ-1, we performed a thermal stability assay monitored by CD, analyzing wt DJ-1 and its C53A and C106A mutants, before and after the reaction with DAQs. For each pair, we observed different profiles, observing a lower thermal stability when Cys106 is involved. The second part of this thesis regards the myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) protein and its role in apoptosis. One of the major anti-apoptotic mechanisms involves the alteration in the expression of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) family members, which consists of 25 genes divided in pro- and anti-apoptotic members. The balance between the levels of pro- and anti-apoptotic proteins is the key aspect, leading the cell to death or survival. Mcl-1 is a member of the anti-apoptotic family, and is a highly expressed pro-survival protein in several cancer cell lines. Even though the mechanism is still under discussion, Mcl-1 plays its anti-apoptotic role interacting with BAK and BAX, pro-apoptotic members of the Bcl-2 family, and the inhibition of this interaction promotes cell death in cancer cells. To identify new small peptides able to bind the BH3 cleft of Mcl-1 and to displace the pro-apoptotic binder, we performed a screening of a 109 different 12-mer peptides using the phage display technique. NMR was used as the technique of choice to validate the binding while Isothermal Titration Calorimetry (ITC) and fluorescence polarization assays (FPA) were used to measure the affinity. Three peptides with affinity in the low micromolar range were identified. The binding mode of these peptides was investigated in silico mixing the information harvested during the NMR studies. BLAST analysis of the identified sequences against the human genome identifies this characteristic pattern in a selection of interesting proteins including glucokinase, hexokinase, and a number of tumor suppressors among others. A short peptide sequence derived from glucokinase exhibits binding to Mcl-1 comparable to that seen for a 12-residue endogenous peptide. The sequence likely binds in a reverse orientation to that of the canonical BH3 helix, thereby placing the conserved glutamic acid residue in the location of the conserved aspartic acid residue of the BH3 sequence. These peptides are the shortest sequences ever observed to bind Mcl-1 and they may warrant development into improved Mcl-1 specific small molecules and peptide-based therapeutics. Further, their identification may provide the basis for increased understanding of possible cross-talk taking place between a number of divergent cellular signaling and homeostatic processes and the regulation of apoptosis.DJ-1 e Mcl-1 sono due proteine anti-apoptotiche coinvolte in diverse gravi patologie come il morbo di Parkinson (PD) e il cancro. Pur appartenendo a famiglie di proteine differenti, entrambi i geni sono coinvolti nel processo apoptotico, inoltre, DJ-1 si trova a monte in un percorso che interessa la morte cellulare attraverso i membri della famiglia della proteina Mcl-1. La prima parte di questa tesi riguarda gli effetti della coniugazione subita da DJ-1 da parte di derivati chinonici della dopamina. Svariate funzioni sono state attribuite a DJ-1 e molti di queste sono collegati con PD, come ad esempio un ruolo protettivo contro lo stress ossidativo, sia come un sensore redox e come antiossidante. Lo stress ossidativo è considerato la principale causa di morte neuronale nel PD e, in particolare, la causa sembra coinvolgere lo stress ossidativo eccessivo generato da auto-ossidazione ed enzimatica della dopamina, che porta alla formazione di chinoni altamente reattivi (DAQ). La reattività del DAQ verso DJ-1 nelle cellule è riportata in letteratura, ma le basi molecolari e strutturali non sono ancora state studiate. I DAQ sono reattivi verso gli atomi nucleofili come l'atomo di zolfo tiolico tipico della cisteina. I tre residui di cisteina sembrano avere molto in ruoli diversi DJ-1: Cys106 è implicato l'attivazione di attività ossidativa e di chaperone. Le altre due cisteine, Cys53 e Cys46, si trovano nell’interfaccia dimerica. L'obiettivo principale della tesi è la comprensione delle modificazioni strutturali indotte dalla coniugazione di DA sui residui di cisteina mediante Dinamica Molecolare, NMR e dicroismo circolare (CD). La presenza di diverse quantità di proteina modificata da uno (150 Da) o due (300 Da) DAQ è stata confermata da SDS-PAGE, da analisi basate sulla radioattività 14C e dalla spettroscopia di massa. È interessante notare che lo stesso campione ha anche mostrato la presenza di una frazione dimerizzata covalente. Per chiarire quale cisteina e’ coinvolta nella dimerizzazione covalente, la stessa reazione è stata effettuata su due mutanti, C106A e C53A. formazione del dimero covalente non è stata rilevata nel mutante C53A. Per caratterizzare le modifiche strutturali, abbiamo acquisito molti 1H-15N heteronuclear single quantum coherence (HSQC) spettri sul WT, i campioni C53A e C106A prima e dopo trattamento con iDAQ. Numerose modifiche nello spettro causati dalla coniugazione con DAQ sono stati osservati. In particolare, un notevole numero di picchi mostra una diminuzione d’intensità, che indica una perturbazione dinamica indotta dalla coniugazione con i DAQ. Una simulazione di dinamica molecolare studio è stato utilizzata per esplorare le basi molecolari della modificazione covalente. Abbiamo osservato un profilo diverso residui fluttuazione causata dalla coniugazione in Cys106, in accordo con gli studi NMR. Abbiamo anche fornito una possibile spiegazione delle basi molecolari che porta alla dimerizzazione covalente. Per chiarire se la modifica covalente di dopamina possa portare ripercussioni sulla stabilità del DJ-1, abbiamo effettuato un test di stabilità termica controllata da CD, analizzando WT DJ-1 e la sua C53A e mutanti C106A, prima e dopo la reazione con DAQ. Per ogni coppia abbiamo trovato diversi profili, osservando una stabilità termica inferiore Cys106 quando è coinvolto. La seconda parte di questa tesi riguarda la proteina myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) e il suo ruolo nell’ apoptosi. Uno dei principali meccanismi anti-apoptotici comporta l'alterazione dell'espressione dei membri della famiglia Bcl-2, che è composta da 25 membri suddivisi in geni pro-e anti-apoptotici. L'equilibrio tra i livelli di proteine pro-ed anti-apoptotico è l'aspetto chiave, conducendo la cellula alla morte o alla sopravvivenza. Mcl-1 è un membro della classe anti-apoptotica, ed è una proteina altamente espressa in diverse linee cellulari tumorali. Anche se il meccanismo è ancora in discussione, Mcl-1 svolge il suo ruolo interagendo con BAK e BAX, membri pro-apoptotici della famiglia Bcl-2, e l'inibizione di questa interazione promuove la morte delle cellule in cellule tumorali. Per identificare nuovi piccoli peptidi in grado di impegnare la cavita-BH3 di Mcl-1 e per inibire l’interazione con i membri pro-apoptotici, abbiamo effettuato uno screening di 109 diversi peptidi 12-mer con la tecnica del phage display. NMR è stata utilizzata come tecnica di scelta per convalidare l’interazione, mentre la Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) e le analisi a fluorescenza polarizzata (FPA) sono stati utilizzati per misurare l'affinità. Tre peptidi con affinità nella gamma bassa micromolare sono stati identificati. La modalità di legame di questi peptidi è stata studiata in silico unitamente con le informazioni raccolte nel corso degli studi NMR. BLAST analisi delle sequenze individuate, identifica queste sequenze in una selezione di proteine interessanti tra cui glucochinasi, esochinasi, e una serie di soppressori tumorali. Una breve sequenza del peptide derivato da mostre glucochinasi dimostra un’affinità per Mcl paragonabile a quella osservata per un peptide endogeno di 12 residui. La sequenza si lega probabilmente con un orientamento contrario a quello tipico dell’elica BH3, ponendo in tal modo i residui conservati acido glutammico in luogo del residuo di acido aspartico conservate della sequenza BH3. Questi peptidi rappresentano la più corte sequenza mai osservata inibire Mcl-1, e possono giustificare lo sviluppo di composti di sintesi specifici e terapie a basati su peptidi. Inoltre, la loro identificazione può fornire la base per una maggiore comprensione delle possibili interazioni che si svolgono tra un numero di differenti proteine nella regolazione dell'apoptosi