Pharmacogenetics of cytochromes in breast cancer treatment

Pharmacogenetic focuses on intersubject variations in therapeutic drug effects and toxicity depending on genetic polymorphisms. In defining the treatment strategies for breast cancer several factors are considered: patients with estrogen-positive breast cancer are treated with anti-estrogens (exemestane) whereas locally advanced or metastatic disease is treated with cytotoxic agents, including cyclophosphamide. In both cases, the presence of genetic alterations of cytochrome P450 (CYP) could influence the absorption, distribution, bioactivation, metabolism, elimination and drug action and thus have consequences in the efficacy and toxicity of treatment. This study is focused on the analysis of genetic polymorphisms of several CYP isoforms involved in cyclophosphamide bioactivation or as exemestane target. The aim of this research is to point out a predictive role of genetic alterations in terms of toxicity and of overall survival after pharmacological treatment in breast cancer patients. Since the difficulty of the enrollment of patients treated with exemestane did not allow us to drawn the same pharmacogenetic/pharmacodynamic correlations. For this subgroup we have assessed only the relative risk to develop breast cancer for all the polymorphisms analysed. One hundred ninty-five patients treated with cyclophosphamide in association with methotrexate and 5-fluorouracil (CMF regimen) were genotypized for a set of genetic polymorphisms of CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4 and CYP3A5 involved in bioactivation of the drug. In the group of 121 patients treated with exemestane the analysis were performed for aromatase (CYP19) gene, which is also the target of the drug. Genotyping was performed using PCR based methods, such as Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), fragment analysis, Pyrosequencing technology and TaqMan technology. Clinical parameters of toxicity (according with NCI-CTC scale) and Overall Survival were monitored by an oncologist. Interesting results were obtained for the correlations between the genotypic and the pharmacodynamic profiles of subgroup of patients treated with cyclophosphamide. The study underlined the significant role of CYP2C9 isoforms involved in bioactivation of cyclophosphamide both in overall survival and in the development of toxicity. Patients carrying at least one mutant allele of CYP2C9*2 (C430T) polymorphism showed an higher risk to develop hepatic toxicity with respect to wild type patients after the 1st cycle of chemotherapy. Similar results were obtained with CYP2C9*3 (A1075C): the presence of at least one mutated allele was found significantly correlated with the development of hepatic toxicity (grade 1-3) after the entire course of treatment. A reduction of enzyme activity due by polymorphism could determine an impaired bioactivation of the prodrug with a consequent accumulation in the liver. Moreover, CYP2C9*3 polymorphism has showed an impact in the overall survival: the presence of at least one mutated allele is related to a reduced survival. This is probably due to a lesser bioavailability of the active molecule. The presence of CYP2C19 G681A polymorphism was correlated with an higher risk to develop severe (grade 3-4) hematological toxicity at the end of the therapy. This variant characterizes the poor metaboliser (PM) allele and thus could be responsible for a reduction in the bioactivation of cyclophosphamide. In conclusion, interesting molecular markers with a predictive value on pharmacodynamics of cyclophosphamide were identified, but their role has to be confirmed in a larger group of patients. A possible application of these parameters in the clinical practice, could be useful to design a tailored treatment based on the peculiar genetic characteristics of each breast cancer patient.La farmacogenetica studia l’impatto di polimorfismi genetici nella variabilità interindividuale dell’effetto terapeutico, in termini di risposta e tossicità, al trattamento farmacologico. Nella definizione del trattamento per il tumore della mammella si tiene conto di numerosi fattori tra cui la condizione ormonale delle pazienti stesse: la presenza di recettori per gli estrogeni a livello tumorale prevede il trattamento con farmaci anti-estrogenici (exemestane) mentre la malattia localmente avanzata o metastatica viene trattata con chemioterapia citotossica (ciclofosfamide). In entrambi i casi, la presenza di alterazioni genetiche a carico dei citocromi P450 (CYP) potrebbe influenzare la terapia in termini di risposta o di sviluppo di tossicità. Lo studio ha previsto l’arruolamento di due gruppi di pazienti sottoposte a terapia farmacologica (ciclofosfamide in regime CMF) o a terapia ormonale (exemestane) per le quali è stato fatto il profilo genetico di alcune particolari isoforme di CYP. Lo scopo dello studio è stato quello di valutare l’effetto dei polimorfismi individuati sull’outcome clinico delle pazienti in modo da fornire delle indicazioni su una possibile “personalizzazione” della terapia in relazione al profilo genetico della paziente. Lo studio si può definire completo per il gruppo di pazienti in trattamento farmacologico in quanto è stato possibile raccogliere i dati farmacodinamici di tossicità e sopravvivenza. Al contrario, per il gruppo in trattamento ormonale l’arruolamento non è stato completato quindi è stato possibile solo avere dei dati preliminari di frequenza dei polimorfismi. Lo scopo principale dello studio è stato quindi quello di valutare l’impatto di polimorfismi a carico dei CYP (siano essi coinvolti nel metabolismo della ciclofosfamide o rappresentino l’enzima target per exemestane) sulla sopravvivenza e sullo sviluppo di tossicità al trattamento. Inoltre, è stato possibile effettuare anche delle correlazioni di tipo caso/controllo per la valutazione del rischio relativo di sviluppo del tumore in relazione alla presenza dei polimorfismi studiati. Sono state quindi individuate le varianti genetiche a carico delle isoforme CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4 e CYP3A5 coinvolte nella bioattivazione della ciclofosfamide e dell’isoforma CYP19 enzima target di exemestane. La genotipizzazione delle pazienti (195 con trattamento farmacologico e 121 con trattamento anti-estrogenico) si è basata su tecniche che utilizzano l’amplificazione del DNA tramite PCR, quali il Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), l’analisi automatizzata dei frammenti, la tecnologia del Pyrosequencing e la tecnologia TaqMan. I dati clinici di tossicità sono stati valutati da un oncologo medico secondo la classificazione NCI-CTC mentre il dato di sopravvivenza è stato considerato l’Overall Survival. Dati interessanti e significativi sono emersi per il gruppo di pazienti in trattamento farmacologico con ciclofosfamide in quanto è stato possibile valutare le relazioni tra profilo genetico e profilo farmacodinamico. Lo studio ha infatti evidenziato un ruolo significativo dei polimorfismi dell’isoforma CYP2C9 coinvolti nella bioattivazione epatica della ciclofosfamide sia per quanto riguarda la sopravvivenza che la tossicità. La presenza di almeno un allele mutato per il polimorfismo CYP2C9*2 (C430T) è correlata con un maggior rischio di sviluppo di tossicità epatica alla fine del primo ciclo di trattamento. La riduzione di attività enzimatica conseguente alla variazione genica potrebbe determinare una minore bioattivazione del profarmaco con un suo accumulo a livello epatico. Inoltre anche il polimorfismo CYP2C9*3 (A1075C) ha evidenziato un impatto non solo sulla tossicità epatica ma anche sulla sopravvivenza. La presenza di almeno un allele mutato riduce la sopravvivenza probabilmente in relazione alla minore disponibilità di farmaco attivo. Inoltre è emersa una correlazione significativa anche tra la presenza di un polimorfismo a carico di CYP2C19 (G681A) e lo sviluppo di tossicità ematologica severa (grado 3-4) alla fine della terapia. La presenza del polimorfismo è associata ad una riduzione nell’attività metabolica dell’enzima quindi potrebbe spiegare una riduzione nella bioattivazione della ciclofosfamide con sviluppo di tossicità. In conclusione, durante questo lavoro di tesi, sono stati evidenziati interessanti marcatori molecolari che potrebbero avere un valore prognostico nel trattamento del carcinoma della mammella con ciclofosfamide se confermati in una casistica più ampia. L’applicazione di questi parametri nella pratica clinica potrebbe essere utile per progettare una personalizzazione del trattamento basato su specifiche caratteristiche genetiche del paziente con carcinoma della mammella