New applications of capillary electrophoresis for the analysis of free fatty acids and amino acids

L’électrophorèse capillaire (CE) est une technique séparative bien connue pour l’analyse des composés biologiques grâce à ses avantages comme sa simplicité de mise en œuvre, elle est peu coûteuse et elle consomme peu d’échantillon (quelques centaines de nanolitres) et surtout de solvants. Ce travail de thèse se concentre tout d’abord sur la mise au point d’une nouvelle méthode d’électrophorèse capillaire pour l’analyse des acides gras libres insaturés C18 en milieu micellaire (MEKC) en utilisant un tensioactif perfluoré, le perfluorooctanoate d’ammonium (APFOA) et avec détection en UV. Un électrolyte optimisé d’APFOA à 50 mM pH~ 9.9-10.1 en présence de méthanol (10 %, v/v) permet de séparer le mélange standard des acides gras mono-, di- et tri-insaturés C18 : l’acide oléique (OA), l’acide linoléique (LA) et l’acide alpha linolénique (ALA) en moins de 20 min. La répétabilité d’analyse de ces trois acides a été évaluée avec les coefficients de variation relatifs sont respectivement LA > ALA. L’OA dispose d’un temps de résidence dans les micelles perfluorées plus long et migre en dernier en CE. Au contraire, l’ALA a un temps de résidence plus court dans des micelles d’APFOA et migre en premier en CE. Ces temps de résidence seraient liés à l’interaction entre groupement carboxyliques dans les micelles. A notre connaissance, c’est la première fois que l’APFOA a été utilisé pour l’analyse des acides gras en CE. De plus, l’APFOA étant un tensioactif disposant d’une volatilité suffisamment élevée, cela donne au milieu de séparation la possibilité d’être utilisée pour coupler la MEKC avec la spectrométrie de masse (MS). Cela ouvre la possibilité de travailler avec les acides gras sur le couplage perfluoro-MEKC-ESI-/MS. Nous nous sommes aussi intéressés à l’analyse du tryptophane (Trp), un des acides aminés essentiels, qui est le précurseur de la synthèse de monoamines comme la sérotonine qui est liée directement à la dépression, ainsi que la tyrosine (Tyr), la valine (Val) et l’isoleucine (Ile). La CE couplée à la fluorescence induite par LED (CE-LEDIF) est une technique répandue depuis des années pour l’analyse des acides aminés (AAs). Cependant, malgré la sensibilité élevée pour détecter la plupart des AAs dans le plasma de la souris par la CE-LEDIF en utilisant le marqueur CBQCA, nos résultats ont confirmé la difficulté pour détecter le Trp marqué (LOD = 6 µM), mais ont trouvé sa cause, la faible fluorescence du Trp dérivé au CBQCA. L’utilisation de la CE combinée à une détection de conductimétrique sans contact (CE-C4D) permet d’obtenir une meilleure limite de détection (LOD) pour le Trp (LOD = 2 µM). La CE-C4D offre ainsi une simple préparation d’échantillon (sans dérivation) et est donc une méthode de choix pour l’analyse du Trp.Capillary electrophoresis (CE) is a well-known separation technique for the analysis of biological compounds with advantages such as the simplicity of installation, the low operating cost and the consumption of very small volumes of sample and solvents. It is widely used in various fields, for example the medical analysis, the pharmaceutical and cosmetic industries and also in food. This thesis focuses on the development of a new CE method with UV detector to separate and identify free unsaturated fatty acids C18 using a fluorinated surfactant, the ammonium perfluorooctanoate (APFOA). The standard mixture of mono-, di- and tri-unsaturated C18 fatty acids (FA): oleic acid (OA), linoleic acid (LA) and alpha linolenic acid (ALA) is separated within 20 min using an optimized background electrolyte of 50 mM APFOA/MeOH (90:10, v/v) at pH ~ 9.9-10.1. Satisfactory repeatability was obtained with interday RDS values for respectively migration time, peak width and intensity of below 1 %, 4-6 % and 3-8 %. If these three FA cannot be separated based only on their interaction with hydrogenated micelles of SDS, the separation carried out here with perfluorinated micelles of APFOA is unexpected because the interaction between hydrogenated compounds and fluorinated compounds is less favorable. NMR, light and X-rays scatterings and transmission electron cryo-microscopy experiments helped to characterize fatty acid-APFOA systems and to explain CE separation. The results allowed us to assume that the affinity of FA with APFOA micelles decreases in the order: OA> LA> ALA. OA has the longest residence time in APFOA micelles and is the last to migrate in CE. In contrast, ALA has the shortest residence time in APFOA micelles and is the first to migrate. This residence time could be linked to the interaction between the carboxylic functions of FA and PFOA. To the best of our knowledge, this is the first time that APFOA has been used for the analysis of fatty acids in CE. In addition, APFOA is a fluorinated surfactant with high volatility, and is a compatible medium for coupling CE/MEKC to mass spectrometry (MS). This opens the possibility of working with fatty acids on the perfluoro-MEKC-ESI-/MS system. We were also interested in the analysis of tryptophan (Trp), one of the essential amino acids (AA) which is also the precursor in the synthesis of monoamines such as serotonin, which plays the role of neurotransmitter and is directly linked to depression. We were also interested in tyrosine (Tyr), valine (Val) and isoleucine (Ile) quantification. Despite the better sensibility to detect almost all essential AA in the mince plasma samples by CE coupled to LED-induced fluorescence (CE-LEDIF), we showed a difficulty to detect labeled Trp-CBQCA (LOD = 6 µM), because of its low fluorescence properties. Using CE coupled to contactless conductivity detection (CE-C4D), Trp can be easily detected (LOD = 2 µM). The last method offers a simple sample preparation (without derivatization) and could be a good choice to analyze the Trp