Investigation of the modulation of the inflammatory response in human oral cells by Angiotensin II

Além da capacidade de regular, de maneira sistêmica, diversas funções essenciais do organismo, como as relacionadas à pressão sanguínea e à homeostase cardiovascular, o Sistema Renina-Angiotensina (SRA) tem sido relatado como um importante imunomodulador de atuação local, em diferentes tecidos. Seus componentes podem exercer atividades pró ou anti-inflamatórias, colaborando com a recuperação do tecido lesionado ou com a manutenção e evolução da inflamação, ocasionando danos teciduais. O fibroblasto é o tipo celular mais abundante do tecido conjuntivo que, dentre outras funções, atuam como sentinela, sendo capazes de expressar diversos mediadores inflamatórios na presença de diferentes estímulos. A hipótese do presente estudo foi que a Angiotensina ll (Ang II), uma vez ligada aos seus receptores AT1 em células orais humanas, seria capaz de promover a liberação de mediadores inflamatórios, colaborando com o estabelecimento e/ou manutenção do processo inflamatório local. Por outro lado, a Ang II, ligada aos receptores AT2, atuaria de maneira oposta às características citadas sobre os receptores AT1. Sendo assim, para melhor compreender o papel da Ang II nas doenças inflamatórias orais, este trabalho teve como objetivo investigar, in vitro, o potencial pró-inflamatório e/ou anti-inflamatório da Ang ll em culturas primárias de fibroblastos orais humanos, após interação com os receptores AT1 e AT2 em condições basais e após pré-estimulo com interleucina 1b (IL1b). Culturas primárias de fibroblastos foram obtidas a partir de explantes de gengiva, ligamento periodontal e polpa dentária (n = 3) e foram caracterizados pela análise morfológica e expressão de FSP (fibroblast surface protein) por imunofluorescência (IF). Citotoxicidade e viabilidade celular foi verificada pelo ensaio AlamaBlueÒ. A expressão gênica relativa foi investigada por Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa (qPCR) precedida da Transcrição Reversa (RT), após estímulos com Ang II, IL1b e drogas antagonistas dos receptores AT1 (valsartan) e AT2 (PD123319). A imunofenotipagem dos receptores AT1 e AT2 foi verificada por citometria de fluxo em situações basais de cultivo e após estímulo com IL1b. Estímulo com Ang II por 24h, não foi capaz de modular a expressão de mediadores inflamatórios em nenhum dos tipos celulares. Em tempos menores de estímulo, as células responderam para alguns mediadores (P<0,05), entretanto, os bloqueadores não foram capazes de antagonizar as respostas observadas. Quando as células receberam a IL1b por 24h antes da Ang II, e foi mantida por mais 3, 6 e 24h, não se observou efeito aditivo ou sinérgico entre estas moléculas. Tanto o receptor AT1, quanto AT2 foram detectados por citometria de fluxo. Os resultados deste estudo sugerem que, nas condições experimentais adotadas, os fibroblastos de gengiva, ligamento periodontal e polpa dentária não demonstraram um papel importante no estabelecimento e/ou manutenção do processo inflamatório local, frente ao estímulo com Ang II.In addition to the ability to regulate, in a systemic manner, several essential functions of the body, such as those related to blood pressure and cardiovascular homeostasis, the Renin-Angiotensin System (RAS) has been reported as an important immunomodulator of local action in different tissues. Its components can exert pro or anti-inflammatory activities, collaborating with recovery of injured tissue or with the maintenance and evolution of inflammation, causing tissue damage. Fibroblast is the most abundant cellular type of connective tissue, which, among other functions, acts as a sentinel, being able to express several inflammatory mediators in the presence of different stimuli. The hypothesis of the present study was that Angiotensin ll (Ang II), once bound to AT1 receptors in human oral cells, would be able to promote the release inflammatory mediators, helping to establish and/or maintain the local inflammatory process. On the other hand, Ang II, linked to AT2 receptors, would act in the opposite way to the characteristics mentioned about AT1 receptors. Therefore, to better understand the role of Ang II in oral inflammatory diseases, this study aimed to investigate, in vitro, the pro-inflammatory and/or anti-inflammatory potential of Ang ll in primary cultures of human oral fibroblasts, after interaction with AT1 and AT2 receptors under baseline conditions and after pre-stimulation with interleukin 1b (IL1b). Primary cultures of fibroblasts were obtained from explants of gingiva, periodontal ligament and dental pulp (n = 3) and were characterized by morphological analysis and expression of FSP (fibroblast surface protein) by immunofluorescence (IF). Cytotoxicity and cell viability was verified by the AlamaBlueâ assay. The relative gene expression was investigated by Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) preceded by Reverse Transcription (RT), after stimuli with Ang II, IL1b and AT1 (valsartan) and AT2 receptor antagonist drugs (PD123319). The immunophenotyping of AT1 and AT2 receptors was verified by flow cytometry in baseline culture situations and after stimulation with IL1b. Stimulus with Ang II for 24h, was not able to modulate the expression of inflammatory mediators in any of the cell types. In shorter times of stimulus, the cells responded to some mediators (P